摘要：冠状动脉疾病是最常见的心血管疾病，最初的器官血流中断和随后的器官血流恢复所产生的心肌缺血/再灌注（ischemiareperfusion，I/R）损伤是急性心肌梗死后伴随各种心脏再灌注治疗策略的重要临床难题。虽然血流量的恢复对于氧气的供应是必要的，但再灌注在促进心肌梗死边缘区血流恢复和心肌细胞挽救的同时，也加重了心肌损伤。线粒体功能障碍已被报道为I/R损伤的原因之一，在介导心肌损伤病理生理过程中起着至关重要的作用。主要综述了I/R损伤中线粒体质量控制系统的分子机制以及确立了以线粒体为潜在治疗靶点的可能性。
急性心肌梗死仍然是世界范围内最常见的死亡原因。经皮冠状动脉介入治疗及时恢复冠状动脉血流是目前指南推荐的急性心肌梗死患者的治疗方案[1-2]。很大一部分心脏损伤发生在冠状动脉血流恢复后的再灌注早期[3]。尽管已知再灌注后会发生损伤，但临床治疗总是侧重于立即再通[4]。线粒体功能障碍和由此产生的氧化应激是包括心脏缺血性损伤在内的几种疾病发病机制的核心[5]。尽管生命科学工作者们对缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）损伤的病理机制已经有了多年的研究，但临床缺乏相应的治疗手段限制I/R损伤患者的预后一直未得到解决[4]。线粒体的融合、分裂、生物发生、自噬及其错综复杂的相互作用构成了线粒体有效的质量控制系统[6-7]。线粒体质量控制在维持细胞内稳态和细胞存活方面起着重要作用[6]。损伤、老化和功能障碍的线粒体的移除是由线粒体自噬介导的，在线粒体动力学适当改变的帮助下，通过线粒体的生物发生产生新的线粒体以满足细胞的能量需求[6]。本文主要综述I/R损伤中线粒体质量控制系统的分子机制以及确立以线粒体为潜在治疗靶点的可能性。
1线粒体质量控制系统与I/R损伤
线粒体发生融合/分裂变化的过程被称为线粒体动力学[8-9]。线粒体外膜融合蛋白1（mitofusins1，Mfn1）和Mfn2对于保护线粒体功能和胚胎发育都是必不可少的[10]。Mfn1的表达减少会使融合/分裂的平衡转向更多的分裂[11]。Mfn2的激活被证实可以逆转线粒体的损伤[12-13]。定位于面向线粒体膜间隙的视神经萎缩症蛋白1（opticatrophy1，OPA1）具备S型（可溶性存在于线粒体膜间隙）和L型（锚定于线粒体内膜）2种亚型[14]。国内外研究一致认为，L-OPA1与内膜融合有关，而S-OPA1与应激条件下的内膜分裂有关[15]。除了介导相邻线粒体内膜的融合，OPA1还控制内膜嵴的完整性[6,16]，并且通过嵴内可溶性细胞色素C（cytochromeC，CytC）的区域化来调节细胞凋亡[17-18]。
线粒体分裂可以是有益的，也可以是有害的，这取决于具体情况[19]。线粒体的分裂是线粒体生物发生所必需的，也是通过线粒体自噬来控制其质量所必需的[20]。动力相关蛋白1（dynamin-relatedprotein1，Drp1）被认为是选择性移除受损线粒体的潜在上游效应因子[21]。Drp1敲除会破坏线粒体分裂，形成延长的线粒体并抑制线粒体自噬，从而在面临I/R损伤时导致更严重的心功能障碍[22]。
自噬体的大量积累既是对I/R应激的反应，也是一种诱导线粒体自噬的情况[23]。当线粒体动力学受损时，由于彼此之间缺乏相互作用，功能受损的线粒体发生群体积累[24]。受损的线粒体不能恢复到健康状态时，线粒体自噬很可能是在细胞凋亡和坏死之前移除受损的线粒体和维持细胞活性的最后保障[6]。Mfn1/2不仅调节线粒体外膜融合，而且还能阻止受损线粒体与健康线粒体融合，从而作为Parkin促进线粒体自噬的底物[25-26]。Mfn2对心脏线粒体自噬的积极作用已经被提出[6]。Mfn2的表达改善了I/R损伤表型，而Mfn2的下调则加重了损伤表型[27]。此外，Mfn2在小鼠心肌代谢转变中起着核心作用，胎儿心肌细胞中的线粒体经过磷酸酶及张力蛋白同源物诱导的蛋白激酶1（PTENinducedputativekinase1，PINK1）-Mfn2-Parkin介导的线粒体自噬，在围产期发生从碳水化合物到脂肪酸的代谢转变，以便它们被成熟的线粒体替代，而不是转录重编程[28]。
线粒体通过诱导生物发生参与能量平衡的调节。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activatedproteinkinase，AMPK）-过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助活化因子-1α（peroxisomeproliferator-activatedreceptorgammacoactivator-1alpha，PGC-1α）轴和沉默信息调节因子2相关酶1（sirtuin1，Sirt1）-PGC-1α轴是调控线粒体生物发生的2条主要途径[29]。I/R损伤发生后，AMPK可以直接磷酸化PGC-1α，也可以通过提高烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamideadeninedinucleotide，NAD+）水平激活Sirt1。PGC-1α被磷酸化后，从细胞质移位到细胞核，触发线粒体的生物发生[29-30]。积极调节线粒体质量体系的想法不仅是选择性地剔除个别受损的线粒体，而是在I/R损伤发生后能量代谢危机时，在整个细胞和器官范围内促进线粒体周转，缓解细胞内环境压力[28]。
线粒体质量控制系统的示意图见图1。
2治疗策略
虽然临床上针对冠心病形成病理因素的早期药物治疗已经层出不穷（临床上调脂、降压、抗血小板聚集等药物的运用），但不得不承认的是，当心脑血管疾病意外发生时，并没有比较适合的治疗手段去应对，尤其是面向21世纪人民生活日益优越的今天。关于线粒体质量控制体系的各个方面，包括融合和分裂动力学、线粒体的生物发生、线粒体自噬与线粒体移植，这些都是具有药物开发前途的领域[31]。
2.1药物治疗：抑制过度分裂，促进适当融合
2.1.1抑制I/R损伤引起的线粒体过度分裂过度的线粒体分裂与细胞死亡增加和心肌I/R损伤相关[32]。心肌I/R后线粒体分裂显著增加。缺血诱导的分裂涉及Drp1移位到线粒体与线粒体分裂蛋白1（fissionprotein1，Fis1）的相互作用，而观察到的线粒体破碎被广泛认为是Drp1介导的线粒体分裂增加的证据[33-34]。抑制线粒体过度分裂被认为是保护I/R损伤后心功能不全的潜在机制[35]。
mdivi-1是一种Drp1GTPase抑制剂，可以选择性地抑制酵母和哺乳动物细胞中Drp1的组装和GTPase活性来抑制线粒体的碎裂[31]。再灌注前15minipDrp1小分子抑制剂mdivi-1（1.2mg/kg），可显著抑制糖尿病小鼠Drp1移位到I/R后的线粒体外膜，减少线粒体的分裂，碎片化程度显著降低，线粒体动力学得到改善，线粒体变得更长、更饱满。免疫荧光结果分析显示线粒体网络增多[36]，线粒体向融合方向转变，细胞内三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate，ATP）浓度也增加[37]，末端标记法阳性细胞数量和半胱氨酸蛋白酶-3（cysteinylaspartatespecificproteinase-3，Caspase-3）活性均降低，线粒体功能和心功能得到显著改善[32,38]。在小鼠心脏骤停体内模型中，mdivi-1可以改善主动脉结扎引起的心力衰竭[39]，减少心肌梗死面积[32]，并提高模型组小鼠的存活率[40]。目前，mdivi-1正在考虑进行临床试验，在细胞和啮齿动物模型中，获得关于mdivi-1的全面的生化、分子、细胞生物学和电子显微镜数据是很重要的[41]。然而，使用大型动物（猪）的急性心肌梗死模型，在再灌注开始时给予mdivi-1治疗未能保留左心室功能或缩小心肌梗死范围。此外，还发现mdivi-1治疗后分裂几乎没有变化，Ong等[42]实验研究也得出了相似的结果，与模型组相比，冠状动脉内单次注射mdivi-1，并不能缩小急性心肌梗死后的心肌梗死面积大小，没有显示出任何心脏保护作用。这些数据表明有必要使用更特异的Drp1抑制剂。
P选择性地抑制Drp1/Fis1的相互作用。除了竞争Fis1与Drp1的相互作用外，它还可以直接与Drp1结合，并抑制其GTPase活性[43]。在常氧条件下，原代培养的心肌细胞只有不到10%的线粒体碎裂。缺血和复氧处理后，（30±5）%的细胞表现出过度的线粒体碎裂（点状线粒体），这种作用在P存在的情况下抑制了（58±4）%，同时P处理使末端标记法阳性细胞减少了（38±2）%，活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）含量降低到基础水平[44]。在再灌注开始时，P对Drp1/Fis1相互作用的急性抑制减少了线粒体的异常分裂，改善了生物能量学，保护新生大鼠心肌细胞的线粒体形态和心肌细胞的功能[31,44]。P选择性地抑制过度的但不是基础的线粒体分裂[45]，从而允许正常的线粒体自噬发生。对R6/2小鼠给予P3mg/(kg?d)8周，心肌线粒体结构显著改善，控制了增加的线粒体Drp1水平，并减少线粒体积聚[45]。P不影响Drp1与另外2个线粒体接头蛋白Mff和MiD51的相互作用，也不影响与线粒体融合蛋白Mfn1或Mfn2的相互作用[43]。用P对野生型小鼠进行5个月的治疗是安全的，对线粒体结构或功能没有影响[46-47]。Drp1适配器蛋白可以为线粒体动力学失调引起的疾病提供新的治疗策略，这可能成为精准医学的诱人目标[48]。此外，P被发现能够抑制ROS的产生，恢复线粒体膜电位和线粒体嵴的整合，并通过阻止Drp1移位到线粒体来防止线粒体肿胀，维持线粒体的完整性[33,43,49]。Dynasore是一种内吞途径的动力蛋白GTPase抑制剂。Dynasore预处理培养的细胞可以保护其免受氧化应激诱导的线粒体分裂[41]，通过在应激细胞中维持线粒体形态和细胞内ATP的机制来保护心脏免受心肌震颤和限制细胞损伤[31]。
2.1.2改善I/R损伤引起的线粒体融合障碍融合是线粒体的一种主要质量控制机制，它使基质成分能够混合，允许受损线粒体的功能互补[50]。活跃的线粒体融合对于维持线粒体的完整性和减少线粒体ROS的产生非常重要。增加线粒体融合的发生率为线粒体相关疾病如I/R损伤提供了一个新的治疗方向[51]。
BGP-15是一种羟胺衍生物，具有广泛的细胞保护作用[52]。细胞培养实验结果表明BGP-15触发的线粒体融合需要激活的OPA1、Mfn1/2和蛋白激酶B（proteinkinaseB，PKB/Akt），预防ROS诱导的线粒体断裂需要存在活跃的外膜和内膜融合机制[51]。此外，Szabo等[51]还发现BGP-15能够激活OPA1GTPase并促进其在体外的聚合，以一种独特的方式引起OPA1的GTP水解，促进线粒体融合，并稳定线粒体内的嵴膜。在Gai等[53]的研究中，与1-甲基-4-苯基-吡啶离子（1-methyl-4-phenylpyridiniumion，MPP+）处理的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞相比，大补阴丸和牵正散处理后均能部分阻止MPP+诱导的Drp1和Fis1的升高以及Mfn1、Mfn2和OPA1的降低，通过维持线粒体动态平衡来改善线粒体损伤。
人参皂苷Rg1是人参二醇单体皂苷之一，被认为是人参的主要药理活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用[54]。Dong等[54]利用心肌H9c2细胞缺氧/复氧（hypoxiareoxygenation，H/R）体外模型研究了人参皂苷Rg1对H/R心肌细胞线粒体动力学的影响。人参皂苷Rg1在6.25～μmol/L内呈剂量相关性地增加细胞抗缺氧再灌注损伤的存活，这与人参皂苷Rg1已有的心肌保护作用一致。与对照组相比，人参皂苷Rg1处理显著增加了H9c2细胞Mfn2蛋白的表达，并呈剂量相关性地上调Mfn2mRNA含量。相反，人参皂苷Rg1对Mfn1、OPA1、Drp1的蛋白表达或mRNA水平没有显著影响。这些数据显示人参皂苷Rg1是通过增加Mfn2表达量来实现线粒体的重构，达到对心肌H/R损伤的保护作用[54]。骨髓间充质干细胞（mesenchymalstemcells，MSCs）移植是一种潜在的心血管疾病治疗方法。低氧预适应可以提高MSCs的存活率，瘦素通过增加OPA1依赖的线粒体融合在低氧预适应增强MSCs存活中起关键作用。通过OMA1泛素化增加L-OPA1的积聚，从而诱导线粒体融合，阻止MSCs的凋亡[55]。
2.2药物治疗：激活线粒体自噬
自噬缺陷会导致废弃线粒体的积累和细胞凋亡，从而增加心肌梗死范围，恶化心室功能[6]。在大多数情况下，线粒体自噬被认为是一种保护或适应机制，因为它有能力清除I/R损伤中积累的有缺陷的线粒体[6]。
辛伐他汀处理的心肌HL-1细胞激活了线粒体分裂和自噬过程，出现Parkin和p62向线粒体易位。通过上调Parkin介导的线粒体自噬来减少遭受I/R损伤的野生型小鼠的梗死范围，这是在Parkin基因敲除的小鼠中没有观察到的现象[6,56]。七氟醚预处理和后处理已被证明对I/R损伤具有保护作用[57-58]。七氟醚后处理治疗不需要任何缺血事件的先验信息，在临床环境中比七氟醚预处理更方便。与I/R组比较，七氟醚后处理组能显著抑制I/R损伤引起的OPA1下降和Drp1、Parkin升高，降低微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associatedprotein1lightchain3，LC3-Ⅱ/I）比值，抑制Beclin1、自噬相关基因（autophagyrelatedgenes，Atg）5和Atg7的表达。七氟醚后处理诱导的线粒体自噬可作为一种促进生存的机制，防止I/R损伤的进一步发展[59]。具有多种治疗作用的白藜芦醇能够显著上调D-半乳糖作用下H9c2细胞Drp1和线粒体自噬蛋白LC3-II的表达，增加Parkin和PINK1的线粒体易位[60]，通过Drp1-parkin-PINK1信号调节线粒体碎片和线粒体自噬，以清除不健康的心脏线粒体。尽管白藜芦醇预处理可有效预防心肌线粒体功能障碍，但白藜芦醇对心肌线粒体动力学和线粒体自噬的有利作用仅在高剂量（10mg/kg）白藜芦醇处理的H9c2细胞中观察到[61]。天麻素是从天麻属植物天麻中提取的一种单体成分，对心肌I/R损伤有保护作用[62]。天麻素预处理通过AMPK-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin，mTOR）信号通路诱导了I/R期间自噬的发生，包括p-AMPK/AMPK的比值升高，p-mTOR/mTOR的比值降低，LC3-II的表达下调以及p62表达的增加。自噬和凋亡之间的竞争关系可能是天麻素减少凋亡的重要因素。与I/R模型组的小鼠相比，天麻素预处理小鼠的心肌梗死面积明显缩小，心功能有所提高[62]。
2.3药物治疗：促进线粒体生物发生
线粒体生物发生相关信号的紊乱与人类心血管疾病发生相关。线粒体的生物发生是在病理条件下试图改善生物能量学参数和细胞质量的潜在药理靶点[63]。瘦素通过激活线粒体生物发生的主要调控因子PGC-1α的表达以及新线粒体形成所必需的另一个重要因子线粒体单链DNA结合蛋白表达水平来增加mtDNA复制，以提高生物能量产生效率[64]。七氟醚是一种常用的挥发性麻醉剂，已在临床和实验研究中表现出了对心肌I/R损伤的保护作用[65-66]。临床上，七氟醚后处理在再灌注开始时立即实施比麻醉预处理更有吸引力，因为后干预可以在再灌注时进行，而不必预测缺血发作[67]。七氟醚后处理持续给药后，可显著提高线粒体功能相关基因转录水平，线粒体蛋白Nrf-1和PGC-1α的表达显著上调[59]。褪黑素已被证明在各种心血管疾病中发挥保护作用[68-69]，对线粒体功能的影响是多方面的，远远超出其对线粒体动力学的调节。褪黑素在病理条件下增加了PGC-1α的表达，并促进了线粒体的生物发生。同时，PGC-1α通过与Drp1启动子结合直接负向调节DRP1的表达，阻止线粒体分裂，进一步发挥心肌保护作用[70]。具有心脏保护作用的白藜芦醇也被发现通过激活AMPK-PGC-1α-雌激素受体相关受体α（estrogenreceptorrelatedreceptorα，ERRα）信号以依赖于沉默信息调节因子3的方式调节线粒体的生物发生，从而显示出对氧化应激的保护作用[71]。PGC-1α被称为线粒体生物发生的“分子开关”[72]，目前大多数被研究的治疗药物集中在激活PGC-1α及其靶基因上，以待激活线粒体生物发生过程，改善I/R损伤背景下的能量危机。
不同治疗药物参与线粒体质量控制体系的作用见表1。
2.4运用分子生物学手段：蛋白靶向降解嵌合体的引入
蛋白质的泛素化是细胞翻译后修饰的一种，通过在底物上添加泛素部分而实现[73]。E3连接酶在这个酶级联中起着极其重要的作用，因为他们要选择被修饰的特定底物[74]。维持蛋白平衡的关键因子是一个称为泛素的小蛋白分子。当它被链接到蛋白上后，会导致这些蛋白被运送到蛋白酶体中进行降解。作为近年来生物化学研究的重大成果之一，泛素化成为研究、开发新药物的新靶点。
蛋白靶向降解是药物研发领域的一个新兴方向，有别于传统小分子是通过阻断蛋白功能来发挥作用。蛋白靶向降解嵌合体（proteolytictargetingchimera，PROTAC）分子在进入细胞后，其结构中的目标蛋白（proteinofinterest，POI）配体可特异性地与相应的靶蛋白结合，而另一端可以募集E3连接酶从而形成POI-PROTAC-E3ligase三元复合物，其中E3连接酶可介导泛素结合酶E2对POI泛素化。三元复合物解离后，被泛素标记的POI被蛋白酶体识别并降解从而选择性地降低靶蛋白的水平。此过程无需靶蛋白配体长时间占据结合位点，只需三元复合物短暂的形成便可瞬时完成目标蛋白的泛素化，并且PROTAC在细胞内可多次循环发挥作用。由于蛋白靶向降解策略，不需要直接抑制目标蛋白的功能活性，药物不需要与目标蛋白长时间和高强度的结合来达到选择性降解蛋白的目的，因此理论上这个策略可以用于任何一个蛋白质。在基因编辑、细胞治疗新技术层出不穷的今天，PROTAC技术作为一种全新的药物发现策略，对于新药的开发意义重大。
受到PROTAC的启发，有必要开始利用PROTAC介导的降解来消除I/R损伤中参与病理形成过程的线粒体质量控制蛋白[75]，靶向线粒体病理改变是对抗I/R损伤的一种有前途的策略[76-77]。利用已有的临床和非临床药物筛选合适的PROTAC，根据线粒体自噬已知的途径探讨现有E3的底物范围，设计正确的临床方案。如基于高分辨质谱，在一个化合物池/库中筛选分析成千上万个化合物，提高筛选通量。应用于发现配体时，该方法能够从高复杂性的化合物池中重复鉴定出高亲和力靶标。通过该筛选方案，利用不同的E3连接酶突变体，进行多轮筛选，可解决E3连接酶突变带来的PROTAC分子耐药性问题。PROTAC技术以其全新的药理学作用模式，及其所带来的诸多优势，展现出了在小分子药物开发领域极为广阔的应用前景。PROTAC技术示意图见图2。
2.5线粒体移植
替代目前心脏保护方案的另一种治疗措施是替换缺血和再灌注期间受损的线粒体。再灌注前被证明是挽救心肌组织和恢复/增强心肌功能的关键时期[78-79]。从未受缺血影响的组织中分离出新鲜的呼吸能力强的线粒体，然后在再灌注前注射到缺血区[75]，这是否能获得局部或整体缺血后心功能恢复的强大受益[80]？为了提高这一有希望的新治疗策略的临床适用性，Cowan等[80]开始研究将外源性线粒体运送到受损心脏的替代方法。对Langendorff灌流的兔心进行30min的缺血，然后再灌注10min。利用罗丹明6G荧光染料对线粒体进行标记。标记的线粒体直接注射到缺血区域，或在再灌注开始时通过冠状动脉进行血管灌注。注射的线粒体定位于注射部位附近，而血管灌注的线粒体导致迅速而广泛的弥散在心脏各处[80]。通过血管灌注传递的线粒体显著增强了整体和局部心肌功能，再灌注结束时测得的梗死面积也通过血管灌注自体线粒体而显著减少。这些发现有助于增加这项技术在心肌梗死后冠状动脉旁路移植术和血运重建的临床应用[81]。线粒体移植示意图见图3。
为了提高临床实用性和减少免疫原性并发症，应从同一有机体（自体）中的远程非缺血组织中分离线粒体以移植到心肌缺血区[82]。在体兔局部心肌缺血再灌注模型中，从同一生物的胸大肌中分离出自体线粒体，并在缺血29min后，再灌注前立即注入心肌[83]。结果表明，线粒体移植可显著缩小心肌梗死面积，提高心肌细胞活力，恢复4周时的心功能。此外，通过多重实验室检测，自体线粒体移植没有诱导任何自身免疫[83]，没有显示与心脏移植排斥反应相关的炎症细胞因子的增加。来自相同个体不同组织类型及其亚群（肌膜下或纤维间）的移植线粒体的心肌保护作用没有发现明显差异[84]。Bertero等[85]从自体骨骼肌及人心肌成纤维细胞分离线粒体，于再灌注前1min经心外膜注入缺血心脏[83-84]或再灌注后即刻经冠状动脉血管灌注[81]。在10min内，注意到左心室血流动力学的改善，ATP含量在数小时内得到提高，这样的治疗效益甚至维持到了再灌注后21～28d[80,83-84]。这一系列的研究结果表明，线粒体移植为缺血性心脏病的心脏保护提供了一种有价值的策略，并为深入了解线粒体的功能和治疗潜力打开了大门[82]。
3结语与展望
心肌细胞由于其高能量利用率和无储备，特别容易受到缺血的影响[60]。线粒体适应多种生理需求，汇聚应激反应，维持细胞内环境平衡[86-87]，是疾病期间细胞命运的关键调节者[88]，是未来研究心肌I/R损伤的潜在治疗靶点[5]。到目前为止，还没有常规临床药物来保护心肌免受I/R损伤[89]。因此，需要新的治疗方法来减少梗死面积，并可以作为经皮冠状动脉介入治疗的辅助治疗，以提高患者的存活率和防止心力衰竭的发生[90]。一般说来，心肌保护的方法要么是联合的，要么是间接的，强调单一的机械路线或复合体，或使用激活剂或抑制剂，或作为单一的治疗方法，或与其他方法结合使用。根据目前已经进行的研究成果，发现成功的对再灌注损伤的临床干预很可能需要补充治疗，在整个心肌恢复过程中处理不同的心脏损伤机制[3]。无论是单独使用还是联合使用，在很大程度上都有利于推动I/R损伤治疗方式的进一步完善。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来源：周曼丽，俞赟丰，冯宇，罗晓欣，兰晓栋，金梦雨，简维雄．线粒体质量控制体系介导心肌缺血再灌注损伤的治疗策略[J].中草药,,52(20):-.
预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇