KeyLaboratoryofBiodiversityFormationMechanismandComprehensiveUtilizationofQinghai-TibetanPlateauinQinghaiProvince
概述
OVERVIEW
CELLCYCLR(IF=2.)刊载了GalinaBelostotskaya团队发表的论文“Characterizationofcontractingcardiomyocytecoloniesintheprimarycultureofneonatalratmyocardialcells:Amodelofinvitrocardiomyogenesis”(DOI:org/10./cc.)。该论文研究了新生大鼠心肌细胞原代培养收缩心肌细胞集落的特征。
前言TNTRODUCTION不可逆缺血损伤后心肌修复的无法满足临床需求，需要更好地了解心脏干细胞(CSCs)的生物学特性)。利用新生大鼠心肌细胞的原代培养，我们描述了由c-kit、SCA或Isl1CSCs产生的收缩心肌细胞集落的形成和成熟，这些集落与主要心肌细胞群体的肥大平行发生。从培养的第八天开始，鉴定出收缩的心肌细胞集落(每1×个心肌细胞的~1-2个集落。最初，自发的弱、异步和心律失常收缩的细胞集落以2-3次/分钟的速度进行了登记。随着时间的推移，集落的收缩变得更加同步和频繁，在第30天培养前收缩率为58-60次/分钟。菌落的特征是CSCs亚型特异性的生长和结构模式。菌落的细胞能够自发的心肌分化，表现出肉瘤α-肌动蛋白和α-肉瘤肌动蛋白的表达，以及收缩机制的成熟和对咖啡因(5mМ)和K(mМ)的典型Ca2反应)。以心肌特异性Ca2诱导的Ca2释放为特征的机电耦合在培养3周时表现明显。因此，CSCs与成熟心肌细胞的共同培养导致心肌细胞集落的形成，类似于体内心肌发生的特征。该模型可用于CSCs心肌分化的基本机制的研究，以及药物测试或其他应用。
方法METHOD
最近在了解干细胞的主要生物学特性方面的进展激发了人们对干细胞潜在治疗应用的兴趣，特别是在组织和器官修复方面。不可逆缺血损伤后心肌再生有限，导致梗死后瘢痕形成，这突出了新的心脏再生疗法的必要性。鉴定成人心脏中几种不同类型的常驻心脏干细胞(CSCs)，包括c-kit、1Isl1、2Sca1、3和产生心脏圈的祖细胞，刺激了基于外源性CSCs的位点特异性传递或通过某些刺激激活宿主CSCs的新再生策略的发展。目前可用的CSCs分离、分选和扩增技术可用于培养中产生大量未成熟的心脏祖细胞，无论是用于研究目的还是用于再生医学的潜在用途。然而，这些祖细胞成熟为完全分化的收缩心肌细胞通常受到CSCs和心脏祖细胞在培养中缺乏自发分化的阻碍。激动剂诱导的CSCs各种亚群定·向分化为心肌细胞已在体外模型中得到明确的证明。特别是在5‘-氮胞苷，催产素和曲古抑素A的化学刺激下，分离和扩增的属于某些亚群的CSCs被分化为心肌细胞，用于分化含有地塞米松的培养基，并与新生心肌细胞和成年心肌细胞共同培养。尽管在这方面取得了重大进展了解CSCs的心肌潜能，应注意的是，在上述研究中，CSCs可分化为具有收缩表型的成熟心肌细胞的比例仅限于0.25~10%，12,13,15,16，而分化过程持续了几周。此外，分离和培养技术的变异性阻碍了不同CSC亚群之间心肌源性特性的直接比较。因此，重要的是建立一个体外心肌发生模型，使属于不同类型的常驻CSCs(c-kit、SCA和Isl1)的单个CSCs的生长/分化能够连续表征，每个CSCs都经历了相同的分离过程和相同的起始条件。在目前的工作中，我们旨在描述这样一个模型，它是基于在新生大鼠心肌细胞原代培养中对3个主要CSC亚群进行全心肌源性分化的演示，从而形成收缩的心肌细胞集落。经过额外的验证，我们得出结论，该模型可用于研究CSCs心肌分化的基本机制，以及产生可能适合作为细胞治疗底物的三维心肌细胞簇。心肌细胞培养中的总细胞计数在第二、第三、第四±第五天分别增加了1.4、0.2、2.2±0.9-、4.2、1.4-和4.8和1.0倍。正如c-有丝分裂的积累所证明的，有丝分裂活性从DIV2急剧增加到DIV4(图1a)。在此期间，用秋水仙素在中期被捕的细胞的百分比平均为20-23%每天。第4天后有丝分裂细胞的百分比显著下降，DIV7-8平均6-7。因此，近70%的心肌细胞在DIV2-5期间进入有丝分裂，而同期有丝分裂指数从1.6%到0.4%不等。平均细胞体积在前6DIV中逐渐增加(图1B)，然后稳定DIV7-8。特别是在DIV1、3±6上，细胞体积分别为±68、、和±μm3。为了估计属于不同群体的培养心肌细胞数量的时间变化，所有细胞都按其体积分为3大类：（1）μm3；（2）-μm3；和（3）μm3。第一个群体由小细胞组成，平均细胞体积为±54μm3，这与成年小鼠心脏中发现的常驻CSCs的尺寸数据以及我们在培养中免疫染色的大鼠CSCs的平均体积数据（见“结果”，收缩心肌细胞集落的结构)很好地对应）。超过8d，这些细胞在细胞总数中的百分比没有超过15%(图1C)。第二个细胞群的特征是细胞体积较大(±μm3)，可能表明心肌细胞增殖。这些细胞的分数体积从DIV1的74%急剧下降到DIV4的4%，表明密集的分裂和随后的发育成成熟的心肌细胞(图1C)。细胞体积μm3的大型心肌细胞最初在培养中以很小的比例存在，但它们的百分比从DIV1显著增加到DIV4(分别为23%和93%，(图1C)。在DIV4上，μm3的心肌细胞可分为4大类：（1）-μm3（30%)；(2）-μm3（48%)；(3）-μm3（15%)；(4）μm3（7%）。培养过程中心肌细胞的生理生长导致多倍体的出现(图1。1D)和多核，主要是双核的肌细胞(图1分别为E和F)。从DIV2开始检测双核肌细胞（~1%）；在DIV8上，双核细胞的体积分数增加到9.5。在整个观察期间，有2个以上细胞核的心肌细胞的比例从0.2%到0.4%不等。图1.新生大鼠心脏心肌细胞体外培养8天。(A)培养8d以上的分裂细胞(c-菌)比例的变化。培养8d以上平均细胞体积的变化。值表示为不同细胞体积±培养心肌细胞数量的平均SD(C)时间变化。(a)平均细胞体积μm3的小细胞群体；(b)平均细胞体积为-μm3的细胞群体；(c)平均细胞体积μm3的细胞群体。多倍体和多核心肌细胞。苏木精染色。数码相机LeicaDFCFX，三目显微镜HT(WPI)，目标×40。多倍体心肌细胞，DIV8。(E)有5个细胞核的心肌细胞，DIV4。(F)双核心肌细胞，DIV6。根据细胞电镀的密度，在原代培养中形成收缩的心肌细胞集落，确定了3种不同的自发收缩模式。首先，在培养7d后，当细胞被镀在5×个细胞/cm2的密度下时，观察到收缩率为25-35次/min的汇合单层心肌细胞(图2A)。在较低的电镀密度(2×细胞/cm2)下，观察到更多的2种模式：（1）在细胞粘附后开始的几天内，以30-50次/分钟的速度记录个体成熟心肌细胞或由2-3个细胞组成的小群心肌细胞的自发收缩(图2B)；和一些镀膜细胞产生高度均匀的不同大小的生长集落(图2C和3)。培养5d后，鉴定出由有丝分裂细胞组成的稀有微集落。集落形成的发生率约为每10万个镀细胞10个集落，其中只有1-2个集落获得了收缩能力。在8-10次DIV上，菌落开始以2-3次/分钟的速度产生罕见的弱收缩。随着时间的推移，集落的收缩变得更加同步和频繁。通过有代表性的视频记录可以观察到18、25和30次DIV（分别为25、46和58次/分钟)同一集落收缩率的逐渐增加）。生长集落内肌细胞的功能分化和收缩集落的结构组织特征如下。
图2.大鼠新生心肌细胞原代培养中自发收缩结构的三种不同模式。(a)密度为5×个细胞/cm2(收缩率：28次/分钟，DIV11)的细胞电镀产生的收缩肌细胞的汇合单层)。个体成熟心肌细胞的收缩(细胞电镀密度：2×细胞/cm2，收缩率：47次/min，DIV3)。培养中收缩心肌细胞集落(细胞电镀密度：2×细胞/cm2，收缩率：10次/分钟，DIV11)。数码相机LeicaDFCFX。用倒置显微镜(PIM-III，WPI)获得图像，客观×40在第10次DIV上，菌落的单个细胞收缩率较低（2-3次/分钟），细胞内Ca2浓度([Ca2]i)的自发弱和异步波动。通过测定激动剂诱导的Ca2+瞬变，测试了肌浆网(SR)的肌钙蛋白乙酰胆碱受体和ryanodine受体(RyR2)的成熟度。根据激动剂诱导的Ca2+反应的模式，在低收缩率的菌落内鉴定出2种不同类型的细胞。第一种细胞类型的特征是对所有应用刺激(乙酰胆碱[Ach]、咖啡因[CAF])的反应明显，而第二细胞类型显示Ca2对K的响应降低（与第一细胞类型相比），这与CAF刺激RYRs后Ca2释放缺乏有关。随着[Ca2]i的自发异步波动，后一观察表明RyRs的不成熟和/或包含第二细胞类型的细胞SR中Ca2的数量不足。然而，即使稍微延长培养时间(DIV12-14)，也会导致集落内心肌细胞的功能分化更先进。特别是，自发钙瞬变在DIV12上的所有菌落细胞中都是同步的、强烈的和均匀的。钙峰率与整个菌落的收缩率一致，平均22次/min。与低收缩率菌落的未成熟细胞相比，DIV12-14上同步收缩菌落的单个细胞对Ach、CAF和K的应用表现出共同的鲁棒Ca2+反应(无花果5c)。此外，在菌落的所有细胞中几乎同步产生自发的Ca2+瞬变，尽管在2个细胞样本之间可以检测到轻微的相位差。这种观察的可能解释可能是菌落的细胞与起搏器细胞之间的不同距离，这可能是定位在菌落的核心。对CAF在成熟菌落细胞中应用的均匀Ca2+反应为建立机电耦合，最终确定菌落内细胞的心肌分化提供了证据。此外，成熟菌落的细胞未能在无钙培养基中显示。图3.新生大鼠心肌细胞原代培养中出现的心肌细胞集落结构。(A)在DIV7上确定的不同大小的殖民地。(B)在DIV8上确定的不同大小的殖民地。苏木精染色。数码相机LeicaDFCFX，目标×10。在3DIV(DIV8-10)期间，活菌落的大小和形状发生动态变化)。数码相机LeicaDFCFX，目标×10结果RESULT
时间推移共聚焦成像用于心肌细胞集落的额外表征。在电镀后5至7天，在培养物中发现了由c-kit、Isl1和Sca1亚群的单个CSCs衍生的不同大小的三维菌落。在DIV13中，Isl1和c-kitCSCs衍生菌落的尺寸与收缩菌落的尺寸相当（见“钙瞬变”）。在DIV10-17上，不同菌落的垂直尺寸从13到97μm不等。上培养第11-13天，Isl1和c-kitCSC衍生菌落的垂直尺寸是相当的，而z轴中SCA-1菌落的尺寸要低得多，平均为19-20μm。然而，在DIV17处，SCA-1菌落的垂直尺寸达到56-60μm。从DIV2到DIV11期间，Isl1CSC衍生殖民地的典型演变如图6A-C所示。菌落的中位光学切片清楚地表明CSCs定位在菌落的核心(图。6d)。特别是，Isl1细胞紧密聚集在菌落中心，垂直尺寸为36μm。成熟心肌细胞经外周排列，包括先前存在的心肌细胞和与Isl1分化的心肌细胞祖先。后一种观点得到了一个事实的支持，即菌落内的一些肌动蛋白阳性的心肌细胞仍然共同表达Isl1抗原。c-kit细胞的菌落特征为CSCs的更弥漫性分布。菌落的外周区也含有肌动蛋白阳性的心肌细胞共同表达c-kit。Sca1CSC衍生的菌落是扁平的(19μm在z轴)，并含有少量的中央嵌套的CSCs（20中的第11节）。图6E显示了c-kit空间不均匀性的一个典型例子CSC衍生集落在心肌分化方面。表达α-sar