摘要：目的采用薄膜水化法制备丹参酮IIA聚乙二醇-聚己内酯（PEG-PCL）纳米胶束，并研究该胶束的细胞内分布及抗心肌缺血再灌注损伤的作用。方法采用正交试验优选丹参酮IIAPEG-PCL纳米胶束的制备工艺条件，优选后的丹参酮IIAPEG-PCL纳米胶束进行粒径、Zeta电位和透射电镜检测表征，并进行稳定性评价，以香豆素-6作为荧光探针，评价PEG-PCL纳米胶束在细胞内的摄取及分布，再进行细胞外存留药物实验，验证PEG-PCL纳米胶束促进药物的细胞摄取性能；采用结扎冠状动脉方法构建心肌缺血再灌注损伤大鼠模型，评价丹参酮IIAPEG-PCL纳米胶束的药效作用。结果丹参酮IIAPEG-PCL纳米胶束的优选工艺条件：丹参酮IIA与PEG-PCL投料比为1.2∶10，转速为r/min，水化温度为37℃，采用旋蒸方式形成薄膜，然后冷冻干燥除尽有机溶剂，在水化超声形成纳米胶束；优选工艺后的丹参酮IIAPEG-PCL纳米胶束粒径为（16.8±0.4）nm，Zeta电位为（?29.8±4.9）mV，载药量为（7.8±0.6）%，包封率为（86.4±5.2）%，稳定性良好；荧光实验表明，PEG-PCL纳米胶束可以促进药物的细胞摄取，进入细胞后，还可将药物聚集在线粒体周围，重合性良好；药效实验结果表明，丹参酮IIAPEG-PCL可以明显降低模型动物血清肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）、心肌肌钙蛋白（cTnI）水平，升高超氧化物歧化酶（SOD）水平，减少心肌梗死面积，改善心肌病理变化，这些药效结果均明显优于丹参酮IIA。结论丹参酮IIAPEG-PCL纳米胶束可以很大程度上提高丹参酮IIA的心肌细胞摄取量，并聚集在线粒体周围，增强药物减轻心肌缺血再灌注损伤的作用。
丹参酮IIA（tanshinoneIIA）是从唇形科鼠尾草属植物丹参SalviamiltiorrhizaBunge中分离得到的脂溶性成分，目前大量的文献报道丹参酮IIA主要集中在心血管药物方面，主要有抗心律失常、抗心肌缺血、改善心室功能和能量代谢，减少心肌梗死面积等多种药理活性[1-7]。心肌缺血再灌注后，线粒体自由基大量生成，攻击线粒体，导致线粒体结构和功能失调，尤其是呼吸功能出现严重障碍，目前文献表明，丹参酮IIA能显著抑制线粒体通透性转换孔（mitochondrialpermeabilitytransitionpore，mPTP）开放，降低心肌缺血再灌注引起的活性氧（ROS）水平，减少心肌细胞凋亡，达到保护缺血心肌的作用[8-9]。尽管如此，丹参酮IIA属于脂溶性成分，体内容易代谢，到达缺血心肌部位的浓度不高，能到达细胞内线粒体的药物量更少。因此，如果能开发一种新型递药系统，将丹参酮IIA递送到心肌细胞线粒体，预期能提高药物的治疗效果。
聚乙二醇-聚己内酯（PEG-PCL）是目前常用的两亲性嵌段聚合物，由PEG亲水端和PCL亲脂端聚合而成，在水中可自组装形成纳米胶束，不仅能解决药物水溶性差和稳定性差的问题，还可促进药物的跨膜转运、高效递送药物[10-12]。因此，拟采用PEG-PCL纳米胶束承载丹参酮IIA，预期促进丹参酮IIA在细胞内的转运，尽量聚集在缺血心肌的线粒体部位，从而很大程度增强药物减少心肌缺血再灌注损伤的药理作用。
1仪器与材料
1.1仪器
LeicaTCSSP8激光扫描共聚焦显微镜，德国徕卡电镜制备有限公司；JEM-2透射电镜，日本电子株式会社；ZetasizerNanoZSP纳米粒度电势仪，英国马尔文公司；FA4B-B电子分析天平，山东达普精密仪器有限公司；TG16台式高速离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司。
1.2药品与试剂
丹参酮IIA购自陕西三原龙生物科技有限公司，批号，质量分数≥98%；PEG-PCL购自上海甄准生物科技有限公司，PEG相对分子质量约，PCL相对分子质量约0，批号，质量分数≥90%，相对分子质量分散指数（PDI）0.3；香豆素-6（coumarin-6，C6）购自上海紫一试剂厂，批号，质量分数≥98%；异丙肾上腺素（ISO）购自百灵威科技有限公司；线粒体红色荧光探针（MitoTrackerTMRed）、细胞核染料（Hoechst）购自ThermoFisherscientific公司；肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）、心肌肌钙蛋白I（cTnI）、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒购自南京建成生物工程研究所；氯化三苯四氮唑（TTC）购自成都贝斯特试剂有限公司；甲醇、乙腈，色谱纯，美国ACS化学试剂公司；其他试剂均为分析纯。
2方法与结果
2.1丹参酮IIAPEG-PCL纳米胶束的制备
2.1.1制备方法精密称取适当比例的丹参酮IIA和PEG-PCL，两者共同置于梨型瓶中，添加一定体积的色谱甲醇，轻微摇晃，促使两者溶解，调节适当的转速，减压浓缩，促使纳米胶束均匀附着在梨型瓶内壁，随着时间的延长，逐渐可见一层淡乳白色的薄膜，取下梨型瓶置于冰水浴中，低温真空冷冻干燥8h以上，除尽梨型瓶中残留的甲醇，加入一定体积的蒸馏水，轻微摇晃使薄膜水化，于设定的温度和时间进行水化，最后将水化后的样品超声处理大约5min，室温下放置，采用0.22μm微孔滤膜进行滤过，即得丹参酮IIAPEG-PCL纳米胶束。
2.1.2正交试验优选制备工艺按照表1设定的因素和水平实验，考察纳米胶束制备过程中药物与PEG-PCL投料比例（投料比，A）、转速（B）、水化温度（C）对丹参酮IIAPEG-PCL纳米胶束制备工艺的影响，最终测定各试验样品纳米胶束的粒径、包封率和载药量，参照文献将这些结果进行综合评分[13]，满分为分，粒径占50%，以粒径最小者为满分50分，包封率和载药量各占25%，以包封率和载药量最高者为满分25分，则综合评分＝粒径×50/最小粒径＋载药量×25/最大载药量＋包封率×25/最大包封率。优选丹参酮IIAPEG-PCL纳米胶束的制备工艺条件，结果见表1，结合表2的方差分析结果，最终优选的条件为A2B3C2，即丹参酮IIA与PEG-PCL投料比为1.2∶10，转速为r/min，水化温度为37℃，按照优选工艺制备条件进行3批验证试验，结果如图1显示，丹参酮IIAPEG-PCL纳米胶束的粒径为（16.8±0.4）nm，Zeta电位为（?29.8±4.9）mV，载药量为（7.8±0.6）%，包封率为（86.4±5.2）%，且重复性和稳定性良好，电镜结果显示丹参酮IIAPEG-PCL纳米胶束表现为形态规则的圆球形，且分散性良好。
2.2粒径分布、Zeta电位测定和电镜分析
采用适量体积的蒸馏水将丹参酮IIAPEG-PCL纳米胶束进行稀释，以ZetasizerNanoZS纳米粒度电势仪检测该纳米胶束的粒径分布、Zeta电位；吸取大约20μL丹参酮IIAPEG-PCL纳米胶束溶液，滴加在目铜网上，于37℃培养箱中烘干30min，再置透射电镜下观察纳米胶束的形态。
2.3包封率及载药量
取超滤离心管（截留相对分子质量为），采用移液枪吸取μL丹参酮IIAPEG-PCL纳米胶束溶液置于管中，以00r/min高速离心5min，由于PEG-PCL属于高分子材料，相对分子尺寸较大，故可截留在超滤离心管内，加入10倍体积甲醇破坏纳米胶束结构，促使丹参酮IIA从胶束结构中解离出来，用高效液相色谱即可测定胶束中包封的丹参酮IIA质量浓度（C内）；超滤膜外为未包裹的游离丹参酮IIA，采用同样的方法即可测定游离丹参酮IIA质量浓度（C外），计算纳米胶束的包封率；另外将离心管内丹参酮IIAPEG-PCL纳米胶束溶液冷冻干燥，称定质量（M），计算丹参酮IIAPEG-PCL纳米胶束载药量。
包封率＝C内/(C外＋C内)
载药量＝C内/M
2.4稳定性
将丹参酮IIAPEG-PCL纳米胶束冷藏于0～4℃冰箱中8周，分别于0、7、14、21、28、35、42、49、56d取出，采用上述方法检测纳米胶束的粒径和Zeta电位。由图2结果可知，丹参酮IIAPEG-PCL纳米胶束在0～4℃冰箱中冷藏8周的粒径和电势，与最初0d的结果比较差异不明显，由此表明，丹参酮IIAPEG-PCL纳米胶束在低温放置过程中，样品比较稳定。
2.5临界胶束浓度（criticalmicelleconcentration，CMC）测定
将PEG-PCL纳米胶束采用适量PBS进行稀释，制备成1～12μg/mL的胶束溶液，再与芘进行混合，室温搅拌6h以上，采用荧光光度仪检测芘在、nm的发射光谱I、I，根据1～12μg/mL系列质量浓度下纳米胶束发出的荧光强度值，计算I/I值，结果如图3所示，胶束内核中的芘荧光强度I/I值随着PEG-PCL纳米胶束质量浓度增大而变化，曲线呈S型变化，曲线拐点处恰好PEG-PCL纳米胶束的CMC，约为6.6μg/mL，该质量浓度很小，由此推测PEG-PCL可自发组装成胶束。
2.6体外释放
取丹参酮IIA（1mg）和丹参酮IIAPEG-PCL纳米胶束（含1mg丹参酮IIA）置于美国进口的Spectrumlabs透析袋（截留相对分子质量）中，将其置于mLpH7.4PBS缓冲溶液中，调节水温为37℃，于预定的时间点0.5、1、1.5、2、4、6、8、12、16、20、24、36、48、60、72、96h进行取样，采用移动枪吸取0.5mL，采用HPLC检测含量，计算丹参酮IIAPEG-PCL纳米胶束体外累积释放率。结果见图4，丹参酮IIA释放较快，在24h内释放量达到96.4%左右，而丹参酮IIAPEG-PCL纳米胶束释药相对比较缓慢，最初释放速率快，随后呈现为缓释状态，在96h内累积释放率为61.4%，由此表明，丹参酮IIAPEG-PCL纳米胶束在释药状态上表现为缓释特性。
2.7细胞摄取
考虑到丹参酮IIA无荧光性质，本实验采用常采用绿色荧光的脂溶性物质C6替代丹参酮IIA，按照上述纳米胶束的制备方法，得到了载C6的PEG-PCL纳米胶束（C6
PEG-PCL），首先将H9c2心肌细胞培养24h，再将C6和C6PEG-PCL纳米胶束（最终细胞液中C6质量浓度为0.1mg/mL）共同孵育，于孵育1、4h后，取出细胞，采用DAPI染色的方法将细胞核染色，然后再在电子荧光显微镜下观察C6在细胞内的摄取情况。结果如图5显示，随着时间的延长，C6PEG-PCL进入细胞内的药物量明显要高于游离的C6，该结果提示纳米胶束能够促进药物的细胞摄取。2.8细胞*性
取对数生长期H9c2心肌细胞，接种于96孔中培养24h，待细胞完全贴壁后，添加丹参酮IIA和丹参酮IIAPEG-PCL纳米胶束样品，经微孔滤膜除菌，各吸取适量加入孔中，使丹参酮IIA浓度为0.5、1、10、20、30、40μmol/L，每个浓度平行3份，共同孵化24h后弃去供试药液，每孔加入40μL含5.0mg/mLMTT的PBS溶液，于37℃避光5h，采用酶标仪，设置波长为nm检测各孔的吸光度（A），计算细胞存活率。结果见表3，丹参酮IIAPEG-PCL在低浓度条件下对H9c2心肌细胞影响较小，在高浓度下*性增加，由此表明，PEG-PCL在低浓度条件下是比较安全的。
2.9细胞内分布
采用同细胞摄取实验方法进行细胞的前期处理，于孵育1、4h后，取出细胞，细胞核采用5mg/mL的Hoechst染色5min（蓝色），线粒体采用50nmol/L的MitoTrackerTMRed染色5min（红色），最后采用LeicaTCSSP8激光扫描共聚焦显微镜拍摄C6在细胞内的分布情况，图片采用ImageJ软件进行处理，计算绿色的荧光物质（C6）与红色的线粒体（MitoTrackerTMRed）重合系数，结果如图6、7所示，带绿色荧光的C6
PEG-PCL纳米胶束进入心肌细胞后，迅速聚集在显红色的线粒体周围，两者重合后呈现很明显的*色，与游离的C6组比较，随着时间的延长，C6PEG-PCL纳米胶束组*色越来越深，ImageJ软件计算的泊桑分布数值体现重合系数，在1、4hC6PEG-PCL纳米胶束的泊桑分布平均数值分别为0.49、0.61，明显高于游离C6组0.28、0.41，由此分析可知，PEG-PCL纳米胶束能促进药物递送到线粒体的效应部位。2.10细胞外药物存留量
采用同细胞摄取实验方法进行细胞的前期处理，然后将丹参酮IIA和丹参酮IIAPEG-PCL纳米胶束（初始浓度10μmol/L）与H9c2心肌细胞共同孵育，于孵育1、4h后，采用移液枪吸取μL培养基，以1r/min高速离心10min，轻轻地吸取上层培养液，并进行前期的样品纯化处理，以HPLC仪测定细胞外药物存留量。结果如图8所示，随着时间的延长，丹参酮IIAPEG-PCL纳米胶束细胞外存留量明显小于丹参酮IIA组，两者存在显著性差异，由此推测，丹参酮IIAPEG-PCL纳米胶束进入细胞内的药物量也相应增多，该结果提示，PEG-PCL纳米胶束能够促进药物的细胞摄取，有助于增加细胞内药物浓度。
2.11心肌缺血再灌注损伤实验
2.11.1大鼠心肌缺血再灌注损伤模型的制备大鼠称定质量后，采用ip3%戊巴比妥钠进行麻醉，连接小型动物呼吸机进行辅助呼吸；沿胸骨左缘第2～4肋间隙开胸，逐层分离胸膜、暴露心脏，小心剪开心包膜，采用无创缝合丝线结扎冠状动脉左前（LAD）降支（假手术组穿线不结扎），以心电图II导联ST段抬高作为缺血的标志，即表明大鼠心肌缺血模型制备成功，最后缝合胸腔。结扎30min后，解开丝线恢复再灌min，以结扎线下心肌颜色变红、心电图ST段下降二分之一为再灌成功。
2.11.2分组给药80只SD大鼠按体质量随机分成4组，每组20只，分别为假手术组：大鼠在LAD下穿线但不结扎，尾iv等量生理盐水；模型组：大鼠造模后尾iv等量生理盐水；丹参酮IIA磺酸钠组：大鼠在结扎前5min，以5mg/kg（以丹参酮IIA计）的剂量尾iv，然后继续进行缺血再灌注造模，造模后每天在相同的时间点注射给药，连续5d，第5天再取大鼠血液，并处死动物，检测心肌梗死面积和心肌细胞凋亡情况；丹参酮IIAPEG-PCL纳米胶束组：大鼠处理方法同丹参酮IIA磺酸钠组，给药剂量与丹参酮IIA组磺酸钠等剂量。
2.11.3心肌损伤标记物、氧化应激指标检测解剖大鼠，打开腹腔，采用无菌注射器抽取腹主动脉血约5mL，于4℃自然凝固30min后，以r/min离心10min分离血清，再将分离后的血清分装并保存?70℃，按照试剂盒说明书测定大鼠血清中CK、LDH、cTnI和SOD水平。结果见表4，与模型组比较，丹参酮IIA磺酸钠和丹参酮IIAPEG-PCL纳米胶束均显著降低血清CK、LDH、cTnI水平，升高SOD水平（P＜0.05、0.01）；丹参酮IIAPEG-PCL纳米胶束对改善这些心肌损伤标记物、氧化应激指标明显优于丹参酮IIA磺酸钠（P＜0.05），由此表明，丹参酮IIAPEG-PCL纳米胶束可以明显提高药物的疗效。
2.11.4心肌梗死面积抽取腹主动脉血液后，迅速剪开胸腔，从各组中摘取10只大鼠的心脏，采用PBS冲洗心脏除尽血迹，沿冠状沟切除右心室，留取左心室，放入切片机，沿心尖到心基部方向平行在结扎线以下将心室约2mm的薄片，4～5片，再将心肌片置1%TTC磷酸缓冲液中，37℃孵育30min后取出，采用滤纸吸干水分，非梗死心肌为浅红色，梗死心肌呈灰白色，采用高清数码相机拍照，照片导入ImageJ图像分析处理软件，计算梗死区面积和左心室面积，计算梗死范围。结果见表5，与模型组比较，丹参酮IIA磺酸钠和丹参酮IIAPEG-PCL纳米胶束均显著减小心肌梗死面积（P＜0.05）；丹参酮IIAPEG-PCL纳米胶束组心肌梗死面积明显小于丹参酮IIA磺酸钠组（P＜0.05）。
2.11.5心肌病理损伤抽取腹主动脉血液后，从各组中摘取10只大鼠的心脏，用预冷PBS反复洗涤，除去残留的血渍和多余的组织块，以4%多聚甲醛固定，石蜡包埋、放入切片机，切成大约4μm厚度的切片。然后再对切片进行HE染色，镜下观察各组心肌病理变化。结果如图9所示，HE染色镜下观察，假手术组大鼠心肌组织没有发现很明显病理改变，心肌缺血再灌注模型组大鼠心肌组织明显的排列紊乱，心肌组织周围明显炎性浸润和心肌纤维断裂等严重的病理损伤，由此说明造模成功；丹参酮IIA磺酸钠和丹参酮IIAPEG-PCL纳米胶束给药后，均可以明显减少模型大鼠心肌的病理损伤，心肌组织排列趋向于整齐，其中丹参酮IIAPEG-PCL纳米胶束对缺血心肌的改善程度明显优于丹参酮IIA磺酸钠。
3讨论
心肌缺血是临床上常见的一种心血管疾病，目前已发展成为发病率和死亡率很高的健康杀手，不仅多发于中老年人，随着社会竞争日趋激烈，年轻人承受的压力也随着增大，作息时间无规律，也很容易患上凶险的心肌缺血性疾病[14]。心肌缺血可导致心肌供氧不足，诱发代谢产物如乳酸、无机磷酸盐与腺苷等大量堆积，严重影响心肌能量代谢，氧自由基大量生成，损伤心肌细胞以及引起心肌细胞内钙离子超载，结果导致心肌收缩性能减弱、心功能下降、恶化[15-16]。丹参酮IIA是丹参根茎的脂溶性成分，具有扩张冠动脉，改善心肌局部供血，减少氧自由基的产生，缓解心肌缺血状况等多种药理作用，目前丹参酮IIA磺酸钠注射液不仅用于治疗冠心病、心绞痛、心肌梗死等心血管疾病，预处理还能够发挥心肌保护作用。但是该药物自临床使用以来，存在较多的配伍禁忌，涉及到的器官系统较多，其中主要为全身过敏性休克、皮疹、严重胃肠道疾病等诸多不良反应[17-18]，可能与该药物注射进入体内后，由于缺乏靶向性，导致该药物在其他部位聚集有关。因此，需构建一种新型的给药系统，不仅解决丹参酮IIA的水溶性问题，还能增强该药的靶向治疗，减少不良反应的发生。
PEG-PCL纳米胶束外周的PEG具有很好的水溶性，PCL内核具有很好的脂溶性，故脂溶性有效成分能很好的与PCL融合在一起，因此，PEG-PCL纳米胶束可以显著提高脂溶性成分的水溶性。不仅如此，PEG-PCL纳米胶束的粒径很小，很容易被细胞摄取，可以携带活性小分子药物跨膜转运进入细胞，显著增强药物的药理作用。本研究采用PEG-PCL纳米胶束承载丹参酮IIA，实验结果显示，丹参酮IIAPEG-PCL纳米胶束稳定性良好、粒径较小，大约（16.8±0.4）nm，可以通过网格蛋白和小窝蛋白的介导跨越细胞膜，加之PEG高分子呈丝状、长链状，可以诱导细胞膜形成临时性孔道，这样一来，纳米胶束可从这些孔道跨膜进入细胞内部，促进药物的细胞内转运[19]。进入细胞后，细胞内存在大量的溶酶体，在细胞内相当于免疫性细胞器，对于外源性成分具有吞噬、降解和清除作用，由于PEG-PCL纳米胶束外周的PEG具有很好的生物相容性和无免疫原性，故能逃逸溶酶体的识别和吞噬，因此，丹参酮IIA被PEG-PCL纳米胶束包裹后，PEG-PCL纳米胶束可以充当“保护伞”，减少药物的降解，促使药物尽量向线粒体部位递送。另外，PEG-PCL纳米胶束外周芒针丝状、手臂式的PEG还能诱导线粒体膜形成临时性孔道，促进药物进入线粒体[20]。本研究采用带绿色荧光的C6代替丹参酮IIA，承载于PEG-PCL纳米胶束内核，荧光试验结果表明，C6
PEG-PCL纳米胶束跨膜转运进入细胞内明显高于C6，随着进入胞内C6增多，与线粒体重合也越来越明显，激光共聚焦试验结果显示，随着时间的延长，C6PEG-PCL纳米胶束组的*色越来越深，代表着绿色的C6与红色的线粒体重合越明显，由ImageJ软件计算的泊桑分布数值定量结果表明，C6PEG-PCL纳米胶束的该数值明显高于C6，由此推断，PEG-PCL纳米胶束有助于药物的线粒体转运。随着PEG-PCL纳米胶束进入细胞内的药物量增多，在细胞外的药物存留量也相应减少，体外细胞实验结果恰好验证了丹参酮IIAPEG-PCL纳米胶束组的细胞外存量显著少于游离丹参酮IIA组，该结果进一步证实了PEG-PCL纳米胶束能促进药物的细胞摄取。既然PEG-PCL纳米胶束能增强药物在线粒体部位的富集，药效作用也应该显著增强。心肌缺血再灌注损伤动物实验结果表明，丹参酮IIAPEG-PCL纳米胶束组可以显著降低模型动物血清CK、LDH、cTnI水平，升高SOD水平，减少心肌梗死面积，改善心肌病理变化，与丹参酮IIA比较具有显著性差异。据此分析，PEG-PCL纳米胶束可以促进丹参酮IIA的细胞内转运，进入线粒体部位的药物量增加，故能很好地发挥药物抗心肌缺血再灌注损伤作用。综上所述，本研究制备的丹参酮IIAPEG-PCL纳米胶束粒径较小，稳定性良好，可以显著提高药物的细胞摄取，促进药物向线粒体转运，能够明显增强药物抗心肌缺血再灌注损伤作用。
参考文献（略）
来源：王松，汪茂胜，周定荣，房芳，窦润鹏.丹参酮IIA聚乙二醇-聚己内酯纳米胶束的制备、细胞内分布及减少心肌缺血再灌注损伤的研究[J].中草药,,51(8):-.
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