徐桂萍1赵萱2付鹃2
1新疆医院麻醉科，乌鲁木齐；2新疆医科大学研究生院，乌鲁木齐
国际麻醉学与复苏杂志,,41(08):-.
DOI：10./cma.j.cn--
基金项目
国家自然科学基金（）
ORIGINALARTICLES
为探讨沉默信息调节因子1（SIRT1）对核因子E2相关因子2（Nrf2）/血红素氧合酶?1（HO?1）信号通路的影响及RSV的保护机制，本研究拟通过建立心肌缺血/再灌注损伤（MI/RI）模型，观察SIRT1、Nrf2、HO?1的变化，进而阐明MI/RI的发生机制及白藜芦醇（RSV）保护机制。
1材料与方法
1.1 实验动物
健康雄性SD大鼠60只，体重~g，由新疆医院动物实验中心提供。所有实验大鼠适应性饲养2周，12h昼夜交替，室温25~28℃、60%湿度下饲养。
1.2 模型制备
参照文献的方法制备大鼠MI/RI模型。禁食、禁饮10h，腹腔注射1%戊巴比妥钠50mg/kg麻醉，仰卧位固定行气管插管后，连接MS小动物呼吸机行机械通气，右侧颈总动脉插管，连接监护仪，连续监测Ⅱ型导联ECG、MAP、心率、心率与收缩压的乘积（RPP）（SBP×心率）。于左胸第4、5肋间处开胸，撑开器暴露心脏，切开心包，显微镜下在左心耳下缘2mm处，用6?0带针线穿过，两端套线圈，结扎冠状动脉，当结扎线远端心肌组织颜色苍白及ECG显示ST段弓背抬高或压低0.1mV为缺血成功标志。结扎30min后，松开结扎线，以抬高的ST段下降1/2为再灌注成功的标志。
1.3 分组及处理
采用随机数字表法将60只大鼠分为4组（每组15只）：假手术组（S组）、缺血/再灌注组（I/R组）、白藜芦醇组（R组）、白藜芦醇+ex组（RE组）。S组只开胸，不结扎冠状动脉；R组、RE组于术前7d腹腔注射RSV15mg/kg，连续7d，1次/d。RE组于缺血前15min尾静脉注射SIRT1抑制剂ex1μg/kg。
1.4 血流动力学监测
记录缺血前（T1）、再灌注min（T2）时的MAP、心率、RPP。
1.5 2，3，5?氯化三苯基四氮唑（TTC）法检测心肌梗死面积
T2时，各组随机取5只大鼠，重新结扎左冠状动脉前降支，尾静脉注射伊文蓝3ml，待大鼠全身蓝染时，立即处死大鼠并取出心脏，用PBS液多次冲洗，?20℃冰箱保存min，将冷冻的心肌沿心脏长轴方向切成厚度约2mm的薄片，用TTC染料进行染色，37℃避光孵育15min，PBS液冲洗3次，中性甲醛固定15min。心肌梗死区被染成灰白色，缺血区染成红色，非缺血区染成蓝色。心肌梗死面积以梗死心肌占缺血危险区心肌面积百分比表示。
1.6 H?E染色检测
T2时，每组取5只大鼠，取左心室心肌组织，置于10％中性甲醛中固定、脱水、石蜡包埋、制备切片，厚约4μm，一部分石蜡切片行常规H?E染色，光镜下（×）观察心肌病理学结果。
1.7 ELISA法检测血清乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶同工酶（CK?MB）水平
T2时，颈总动脉取血3ml，离心后取上清液（离心半径12cm，r/min，离心10min）。采用ELISA法检测血清LDH、CK?MB水平。
1.8 硫代巴比妥酸法及*嘌呤氧化酶法检测心肌丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性
T2时，取少量左心室心肌组织，置于液氮罐中速冻后，于?80℃低温冰箱中保存；取冻存的心肌组织制备10%组织匀浆，采用硫代巴比妥酸法测定心肌MDA含量，采用*嘌呤氧化酶法测定SOD活性。严格按照试剂盒操作步骤进行测定。
1.9 PCR法检测心肌SIRT1、Nrf2、HO?1mRNA水平
T2时取左心室心肌组织mg，采用RT?PCR法检测心肌SIRT1mRNA、Nrf2mRNA、HO?1mRNA水平。采用RNA提取试剂盒提取心肌组织RNA，然后将RNA进行逆转录，作为下一步PCR模板，最后按照RT?PCR说明书进行操作。引物顺序：SIRT1，上游引物5′?AGGCGGATTTCTGAGTTCGA?3′，下游引物5′?CGTCCCTTGTAATGTTTCCC?3′；Nrf2，上游引物5′?TGGCAGAGACATTCCCATTTGTA?3′，下游引物5′?ATCAGTCATGGCCGTCTCCAG?3′；HO?1，上游引物5′?AGGTGCACTCCGTGCAGAG?3′，下游引物5′?TCCAGGGCCGTATAGATATGGTACA?3′。反应条件：94℃s、92℃30s、54℃30s、70℃30s，连续36个循环，采用2?△△Cr法计算SIRT1，Nrf2、HO?1mRNA的相对表达量。
1.10 Westernblot法检测心肌SIRT1、Nrf2、HO?1蛋白水平
再灌注取血后，处死大鼠取下心脏，取左心室心肌组织mg，严格按照总蛋白提取试剂盒说明进行总蛋白提取。取50μg总蛋白进行电泳、转膜，用含5%脱脂奶粉的缓冲液37℃封闭2h。分别加入相应的一抗，SIRT1、Nrf2、HO?1，稀释度均为1∶0，4℃孵育过夜。TBST漂洗3次，加入二抗，37℃孵育1h，Tris缓冲液吐温20（TBST）漂洗3次，电化学发光显影。用ImageJ系统对印记条带进行灰度分析，以目的蛋白条带与β?actin条带灰度值的比值反映目的蛋白表达水平。
2结果
2.1 各组大鼠血流动力学指标比较
I/R组、R组、RE组T2时心率、MAP、RPP低于T1（P0.05）；T2时I/R组、RE组心率、MAP、RPP低于R组（P0.05）。见表1。
2.2 各组大鼠心肌梗死面积百分比和血清LDH、CK?MB水平比较
与S组比较，I/R组、R组、RE组心肌梗死面积百分比和血清LDH、CK?MB水平增加（P0.05）；与R组比较，I/R组和RE组心肌梗死面积百分比和血清LDH、CK?MB水平增加（P0.05）。见表2。
2.3 各组大鼠心肌组织学变化比较
光镜下，S组心肌纤维排列整齐，结构完整，横纹清晰，心肌细胞无水肿，未见炎性细胞浸润；I/R组和RE组心肌纤维排列杂乱，横纹消失，心肌纤维成片断裂，间质血管充盈扩张，细胞核固缩现象明显，炎性细胞浸润；R组细胞排列相对整齐，无片状心肌纤维断裂现象，偶见细胞核固缩，病理学损伤较I/R组和RE组均减轻；RE组较R组心肌纤维排列杂乱，核固缩现象明显，炎性细胞浸润明显。见图1。
2.4 各组大鼠心肌MDA含量和SOD活性比较
与S组比较，I/R组、R组、RE组心肌MDA含量增加、SOD活性降低（P0.05），与R组比较，I/R组、RE组大鼠心肌MDA含量增加、SOD活性降低（P0.05）。见表3。
2.5 各组大鼠心肌SIRT1mRNA、Nrf2mRNA、HO?1mRNA水平比较
与S组比较，I/R组、R组、RE组心肌SIRT1mRNA、Nrf2mRNA、HO?1mRNA水平上调（P0.05）；与R组比较，I/R组、RE组大鼠心肌SIRT1mRNA、Nrf2mRNA、HO?1mRNA水平下调（P0.05）。见表4。
2.6 各组大鼠心肌SIRT1、Nrf2、HO?1蛋白水平比较
与S组比较，I/R组、R组、RE组心肌SIRT1、Nrf2、HO?1蛋白水平上调（P0.05）；与R组比较，I/R组、RE组心肌SIRT1、Nrf2、HO?1蛋白水平下调（P0.05）。见表5、图2。
3讨论
本研究结果显示，I/R组大鼠心肌细胞MDA含量升高，SOD的活性下降，同时血清LDH、CK?MB水平升高，心肌出现病理损害，说明I/RI时产生的氧化应激反应导致心肌细胞损伤。与I/R组比较，R大鼠心肌MDA含量降低，SOD活性增加，同时血清LDH、CK?MB水平降低，心肌梗死面积百分比也有所降低，表明RSV在一定程度上减轻了大鼠MI/RI所造成的氧化应激反应，改善了I/RI后的血流动力学变化，对减轻心肌细胞损伤程度等方面起到重要保护作用，这与之前的研究结果一致。
在本研究中，在假手术组中，SIRT1mRNA及蛋白均少量表达，且MI/RI后SIRT1mRNA及蛋白表达均上调，说明I/R可以激活SIRT1的表达，提示SIRT1对I/R导致的心肌损伤起保护作用，但这种适应性调节不足以缓解I/RI，经过RSV处理后，SIRT1mRNA及蛋白表达进一步增加，心肌病理损伤减轻，进一步证实RSV通过增强SIRT1的表达产生心肌保护作用。Nrf2作为一种内源性抗氧化因子，在静息条件下，Nrf2与细胞骨架相关蛋白Keapl结合存在于细胞质中，处于失活状态。在I/RI过程中，大量氧自由基产生使组织处于氧化应激条件下，Nrf2被激活，从细胞质转运至细胞核，调控下游抗氧化因子如HO?1等基因的表达。
在本研究中，在I/R前给予RSV增加心肌表达SIRT1，同时我们发现，Nrf2、HO?1mRNA及蛋白均增加，同时反映氧化应激严重程度的指标——MDA相应降低，反映抗氧自由基能力指标——SOD相应上调。为明确SIRT1与Nrf2/HO?1信号通路的关系，本实验进一步使用SIRT1抑制剂ex后，发现ex不仅使SIRT1mRNA和蛋白的表达降低，也可使Nrf2、HO?1mRNA和蛋白的表达水平同步下调，加剧氧化应激反应，并抑制RSV的心肌保护作用。提示SIRT1可能在MI/RI中对Nrf2/HO?1信号通路产生调节作用，且RSV减轻MI/RI的机制可能通过激活SIRT1的表达进一步激活Nrf2/HO?1信号通路有关。
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