胡东 王晓丽 徐桂萍
新疆医院，乌鲁木齐
国际麻醉学与复苏杂志,,40(08):-.
DOI：10./cma.j.issn.-..08.
REVIEWARTICLES
年发表于《美国医学会杂志》的最新中国2型糖尿病流行病学研究显示：中国成年人糖尿病患病率10.9%，其中新诊断糖尿病患病率为6.9%，既往已知糖尿病患病率为4.0%，40岁以下糖尿病患病率高达5.9%，糖尿病患者的数量与日俱增。糖尿病是缺血性心脏病的主要危险因素，它改变了葡萄糖代谢，胰岛素抵抗导致心脏结构和功能异常，包括左心室功能障碍、心脏肥大和心肌纤维化。高血糖增加心脏成纤维细胞和血管平滑肌细胞的增殖，破坏内皮细胞的功能，导致微血管损伤和血流动力学的改变，所有这些病理生理变化，大大增加了糖尿病心肌缺血/再灌注损伤（myocardialischemia/reperfusioninjury,MI/RI）的易感性和严重程度。而氧化应激主要调节糖代谢障碍，是糖尿病引起加重MI/RI的主要因素。核因子E2相关因子2（nuclearfactor-erythroid2-relatedfactor2,Nrf2）/抗氧化反应元件（antioxidantresponseelement,ARE）信号通路是增强机体抗氧化功能最重要的保护性信号途径之一，它与氧化应激有着紧密的联系。Nrf2的表达增加使其下游的抗氧化酶增加，减轻氧化应激，从而减轻糖尿病心肌缺血/再灌注所带来的损伤。本文就Nrf2/ARE信号通路及氧化应激在糖尿病MI/RI中的保护机制进行综述。
1 氧化应激在糖尿病加重MI/RI中的作用
氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，氧化系统和抗氧化系统失衡，体内高活性分子［如活性氧自由基（reactiveoxygenspecies,ROS）和活性氮自由基（reactivenitrogenspecies,RNS）］产生过多，氧化程度超出氧化物的清除，从而导致组织损伤。在糖尿病的病理环境中，高血糖症、高脂血症和胰岛素抵抗会产生大量的自由基，增加氧化应激的程度，加重胰岛素抵抗，使得蛋白质变性，脂质过氧化。在糖尿病心脏中，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（nicotinamideadeninedinucleotidephosphateoxidase,NADPH）的产生，内皮型一氧化氮合酶（endothelialnitricoxidesynthase,eNOS）的解耦联，蛋白激酶C（activationofproteinkinaseC,PKC）的激活，晚期糖基化终产物（advancedglycationend-products,AGEs）与其受体（receptorforAGE,RAGE）的传导，*嘌呤氧化酶（xanthineoxidase,XO）和12/15脂氧合酶（12/15Lipoxygenase,12/15LOX），所有这些都会使ROS和RNS产生过多，从而加重糖尿病MI/RI的程度。
1.1 ROS和RNS的产生
ROS是一组短寿命的低分子化合物，其衍生自各种氧化反应，包括超氧化阴离子（·O2-）、羟基（·OH）、过氧化氢（H2O2）和次氯酸（HOCl）。在生理条件下，心脏组织含ROS很少，经线粒体电子传递链（mitochondrialelectrontransportchain,ETC）泄漏的·O2-等，通过超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）催化成含较少细胞*性的H2O2，最后会被转化为水和分子氧系统。但是，在糖尿病情况下，心脏组织的氧化动态平衡状态被破坏，·O2-的生成显著增加。高血糖增加了心脏游离脂肪酸的水平，激活了核转录因子及PKC，从而导致了ROS的增加和谷胱甘肽过氧化物酶的减少。ROS使得线粒体通透性转化孔通道（mitochondrialpermeabilitytransitionpore,MPTP）开放，导致在大鼠心肌缺血/再灌注中心脏收缩功能不全和心肌组织的损害。糖尿病心肌RNS产生也很多，包括一氧化氮（NO）和二氧化氮（NO2）的增加。在心肌缺血/再灌注期间，超氧化物与NO的快速反应形成高活性中间体［过氧化亚硝酸基（·ONOO-）］。随着增加细胞内酸化，·ONOO-变得更加质子化，形成过氧亚硝（ONOOH），然后迅速变成NO2和·OH。·ONOO-/ONOOH是强大的细胞*素氧化剂，与心肌缺血/再灌注期间产生的·OH一样会导致氧化损伤和硝化。
1.2 NADPH氧化酶
NADPH氧化酶是Nox（NADPHoxidase）家族的成员之一，是主要在吞噬细胞（即嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞）中产生ROS的酶。在7种哺乳动物Nox同种型（Nox1~5和Duox1~2）中，Nox2和Nox4主要表达在心脏组织。研究显示，在暴露于高葡萄糖的心肌细胞中，NADPH氧化酶的活性和Nox4的表达会增加。在糖尿病小鼠模型的心脏组织中，通过NADPH氧化酶产生的ROS增多。此外，在1型和2型糖尿病引起的心肌肥大和心肌纤维化中，心肌的Nox1和Nox2的表达增加。而且，在链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠模型中，由于Rac1缺陷导致的NADPH氧化酶活化的减少已被证明对心肌功能具有有益作用。综合以上数据表明，NAPDH产生的ROS与糖尿病心血管并发症有关。
1.3 解耦联的eNOS
心血管系统通过一氧化氮合酶（nitricoxidesynthase,NOS）的活性合成NO，NOS分为3个亚型：eNOS、神经元型NOS（neuronalnitricoxidesynthase,nNOS）、诱生型NOS（induciblenitricoxidesynthase,iNOS）。正常生理情况下，eNOS二聚体与L-精氨酸的相互作用在四氢生物蝶呤（tetrahydrobiopterin,BH4）的辅助下生成NO。但是在氧化应激的情况下，BH4转化为二氢生物蝶呤（dihydrobiopterin,BH2），BH2参与eNOS二聚体的解耦联，生成的不是NO而是·O2-。然而NOS脱耦联所产生的·O2-，与NO迅速结合生成·ONOO-，又会进一步地抑制BH4活性而增强氧化应激。在糖尿病血管病的早期阶段，NO及BH4的生物利用度都会降低，这有助于糖尿病并发症的发展。Ding等在糖尿病大鼠的心肌部位注射细胞沉默调节蛋白1的腺病*载体,增加eNOS磷酸化并减少糖尿病心肌中的eNOS乙酰化，减轻了糖尿病大鼠MI/RI程度。此外，糖尿病诱导的NADPH进一步增加也易使心肌对NOS解耦联及产生·ONOO-。
1.4 破坏线粒体功能
线粒体是细胞内的细胞器，是葡萄糖氧化代谢合成ATP的场所，是ROS产生的主要部位。在正常生理情况下，这些活性氧可以被线粒体自己的蛋白水解系统清除，以保持线粒体功能。然而，在高糖状态下，氧化代谢增加，线粒体就会产生过多·O2-。生成的·O2-可以通过SOD转化为H2O2，然后通过抗氧化酶解*成水和过氧化氢酶。但是，H2O2也可以分解成具有破坏性的OH·自由基，导致MPTP的大量开放和ETC的泄漏。而且在糖尿病心肌中，线粒体蛋白水解等系统与线粒体呼吸能力也一起受损，产生过多的H2O2，导致过多的ROS无法清除。线粒体的H2O2及ROS产生增加会损害膜成分中的脱氧核糖核酸、蛋白质和脂质，并最终导致线粒体功能障碍，进而加重心肌损伤。综上，氧化应激反过来可能会引起糖尿病状态下的线粒体功能障碍。
1.5 其他因素
由于慢性高血糖和氧化应激增加，AGEs在糖尿病环境中产生。AGEs积聚在身体的许多部位，包括糖尿病患者的心脏和大血管组织。这些修饰蛋白也与受体（如RAGE）相互作用以诱导氧化应激，同时证据表明AGEs结合RAGE会导致NADPH的激活和MPTP的形成。XO在心肌细胞胞质中会产生H2O2和·O2-。在糖尿病心肌重塑方面，XO在糖尿病小鼠中被激活，会引起心肌肥大、纤维化、心脏扩张和功能障碍。12/15LOX是氧化酶的家族，12-脂合酶和15-脂合酶将花生四烯酸转化成12-羟基二十碳四烯酸和15-羟基二十碳四烯酸，并释放ROS。与野生型小鼠相比，敲除12/15LOX的糖尿病小鼠表现为心肌纤维化减少，表明破坏12/15LOX的正常活性对糖尿病心肌具有保护作用。
2 Nrf2/ARE信号通路的基本结构
Nrf2/ARE抗氧化系统的活性只有在氧化应激的时候才能开启，在低氧化应激条件或者正常生理情况下，Nrf2与果蝇肌动蛋白结合蛋白Keap1（kelch-likeECH-associatedprotein,Keap1）结合锚定于细胞质中肌动蛋白的细胞骨架上。该复合物使得Nrf2蛋白可以与泛素蛋白反应，当脱氧核糖核酸转录没有被激活时，泛素化导致许多转录因子（包括Nrf2）在蛋白酶体的亚细胞器中被分解。但是，为了使Nrf2不被分解，可以通过阻断Nrf2与Keap1之间的联系。Keap1蛋白含有几种具有可以与ROS和亲电子试剂反应的巯基的半胱氨酸残基，由此断裂了Keap1和Nrf2之间的联系。一旦键被破坏，Nrf2易位至细胞核。在核内，Nrf2与Maf蛋白形成一个异源二聚体，然后绑定在脱氧核糖核酸启动子区域的ARE上，启动下游抗氧化基因和各种解*酶的转录与激活［包括SOD、过氧化氢酶、硫氧还蛋白还原酶、醌氧化还原酶-1、血红素氧合酶-1（hemeoxygenase-1,HO-1）、谷胱甘肽S-转移酶和γ-谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基等］，从而发挥强大的抗氧化作用，提高细胞的抗氧化应激能力。
3 糖尿病心肌缺血/再灌注与Nrf2的关系
3.1 Nrf2/ARE在糖尿病心肌缺血/再灌注的重要性
研究已经证明了Nrf2/ARE信号通路在预防糖尿病并发症和氧化应激诱导的心肌细胞损伤中具有重要作用。有研究分析，在糖尿病患者心脏的左心室观察到Nrf2的表达显著降低，同样这种现象在5个月的糖尿病小鼠模型中也能观察到。下游抗氧化因子热休克蛋白60、HO-1和NADPH等在糖尿病心肌组织中的表达因受氧化应激影响而下降。此外，已经证明Nrf2和其下游靶基因在糖尿病（db/db）小鼠的心肌细胞中下调，这加剧了糖尿病心肌功能障碍、肥厚和炎症反应，也加剧了糖尿病大鼠MI/RI。因此，高血糖导致的Nrf2功能丧失加剧了氧化应激并导致严重的心肌损伤。在病理状态下，Nrf2基因敲除小鼠的心肌表现出结构和功能异常,异丙肾上腺素刺激成年糖尿病小鼠的原代心肌细胞收缩也显示依赖于Nrf2，来自Nrf2敲除小鼠的心肌细胞高糖培养后细胞凋亡显著增加。在心肌缺血/再灌注模型中，糖尿病早期及进展期可能会上调心肌中Nrf2，作为早期阶段的补偿机制，在糖尿病晚期则导致产生额外的ROS或RNS，并导致Nrf2及其下游抗氧化酶的表达下降，使得缺血/再灌注的心肌损伤加重，这可能与糖尿病破坏了Nrf2的激活机制有关。因此，这些研究结果突出了Nrf2的保护机制在糖尿病心肌缺血/再灌注中的重要性。
3.2 药物处理
3.2.1 药物激活Nrf2的机制
在糖尿病MI/RI中，内源性的Nrf2不足以抵抗MI/RI所带来的损伤，所以需要体外的药物支持来激活Nrf2，Nrf2的主要激活机制包括：①上游激酶的激活（如蛋白激酶B），细胞外信号调节激酶以及PKC家族中的众多成员，它们可磷酸化特定位点有利于从Keap1中释放Nrf2；②作用于Keap1的半胱氨酸残基，破坏Nrf2-Keap1结合，使之解耦联，有利于Nrf2解离；③阻碍Nrf2泛素化和Nrf2的蛋白酶体降解，从而减少Nrf2的分解。
3.2.2 药物激活Nrf2在糖尿病MI/RI中的作用
Li等通过对Nrf2基因敲除，发现取消了脂联素对糖尿病心肌保护作用，进一步证明了脂联素可以通过Nrf2激活下游的HO-1，减轻链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠的心脏功能障碍。You等合成一个Aza白藜芦醇-查耳酮衍生物6b，在链脲佐菌素诱导的1型糖尿病小鼠中，用6b口服给药16周，Nrf2表达上升，显著减轻心脏肥大、细胞凋亡和纤维化。另外，在1型糖尿病大鼠模型中，萝卜硫素激活Nrf2，使其表达增加，减轻心肌氧化损伤、炎症和高糖诱导的纤维化反应。研究表明，硫化氢保护db/db糖尿病小鼠心肌，通过激活Nrf2/HO-1信号对抗MI/RI。二烯丙基三硫化物被认为是一种强大的硫化氢供体，通过减少氧化应激、细胞凋亡和内质网应激损伤，上调Nrf2和细胞沉默调节蛋白1的表达，来改善1型糖尿病大鼠MI/RI。
Liu等对糖尿病大鼠用桑葚颗粒预处理1个月，然后进行心肌缺血/再灌注，结果显示桑葚颗粒对缺血/再灌注心肌起到保护作用，并且Nrf2的表达明显增高，在Nrf2敲除小鼠中桑葚颗粒的保护作用则被废除。杨梅素减轻了糖尿病大鼠的心脏肥大、细胞凋亡和间质纤维化，增加了Nrf2/HO-1途径，增强SOD的抗氧化应激能力，并降低丙二醛的生产。在果糖喂养的糖尿病大鼠模型中，给予大蒜匀浆喂养，结果大蒜匀浆增加糖尿病心肌的硫化氢水平，激活磷脂酰肌醇3激酶/丝氨酸途径并增加Nrf2和降低Keap1水平，有效减少心肌肥厚和果糖诱导的心肌氧化应激。db/db小鼠心脏中，缺锌加剧了心肌功能障碍和肥厚，并伴有显著增加的纤维化（升高的胶原蛋白积累）和炎症反应。
这些结果暗示缺锌促进了db/db糖尿病小鼠中心肌损伤的发展和进展。缺锌对db/db糖尿病小鼠心肌损伤的加剧作用可能与进一步抑制Nrf2的表达和功能有关。蛋白酶体抑制剂MG-增加Nrf2的表达，可以通过减少炎症和降低心肌病的风险来减轻MI/RI。微小RNA（microRNA,miR）还可以调节心肌细胞中的Nrf2，对糖尿病心肌起到保护作用。miR-的抑制可以减少链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠心肌的氧化应激以及减少心肌细胞凋亡。另外，miR-模拟物加重了高糖诱导的氧化应激和细胞凋亡，并且通过应用Nrf2处理逆转这种作用，表明Nrf2在miR-的作用中起关键作用。因此，增强内源性Nrf2和随后的抗氧化途径是减轻糖尿病心肌损伤的潜在策略。
3.2.3 麻醉后处理及缺血后处理
七氟醚后处理保护心肌免受缺血/再灌注损伤。然而，在糖尿病大鼠心肌中，七氟醚后处理的心肌保护功能丧失，Nrf2及其下游HO-1表达减少。虽然七氟醚后处理心肌保护作用可以被高血糖取消，而MPTP的抑制可以使这种心肌保护作用效果得以恢复。同样异氟醚后处理对MI/RI的保护作用在糖尿病大鼠中也消失了，主要是糖尿病环境破坏了布拉马相关基因1/Nrf2/转录激活子3信号通路。一些挥发性麻醉药（如地氟醚）已被使用在糖尿病患者的心肌缺血/再灌注开始时，应用时显示出心肌的保护作用。研究证实缺血后处理对正常心肌有保护作用，然而现有的研究表明糖尿病破坏心肌保护机制，进而减弱心肌保护效应。Altunkaynak和Ozcelikay对糖尿病大鼠的心脏进行离体缺血/再灌注，缺血40min，然后再灌注40min，进行缺血后处理即在再灌注开始时6次10s缺血和10s再灌注的重复循环诱导，发现缺血后处理在糖尿病心脏中没有产生任何进一步的保护，糖尿病心肌中肌钙蛋白Ⅰ水平降低，在缺血后处理后也没有明显改变。可是，这种缺血后处理作用的消失是否跟糖尿病环境破坏的Nrf2有关，却没有相关研究。
4 Nrf2的不良影响
Nrf2是一把双刃剑。氧化应激不仅跟2型糖尿病的发生、发展有关，还在正常的胰岛素信号转导和β细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌中起到重要作用。因此，Nrf2的过度或异常激活可能导致体内这些所需的ROS信号过度减少，产生进一步的不良影响。有研究表明，Nrf2的基因改变并不能阻止饮食诱导的小鼠肥胖，但Nrf2缺乏可能通过其对胰岛素信号转导的影响来改善葡萄糖稳态。同时Nrf2也可以调节细胞的增殖，有研究发现，Nrf2及其下游基因在许多癌细胞系和人类癌症肿瘤组织中过表达，Nrf2的活化似乎有助于癌症发展和癌细胞的化疗耐药。此外，Nrf2和Keap1的突变已经在大部分恶性肿瘤中被发现，而且已经报道了几种具有抗肿瘤功效的Nrf2抑制剂，这表明对Nrf2抑制是癌症治疗有希望的策略。但是这些发现不应妨碍我们追求靶向Nrf2/ARE通路来治疗糖尿病心肌病，该通路的抗氧化作用在糖尿病心肌保护中是非常重要的。
5 总结与展望
综上所述，氧化应激是加重糖尿病MI/RI的重要原因之一。而Nrf2/ARE信号通路是一条重要内源性的抗氧化保护通道，它通过激活下游的抗氧化因子及解*酶，降低心肌氧化应激水平，增强心肌抗氧化能力，从而可以减轻糖尿病MI/RI。本文对近几年减轻糖尿病MI/RI的药物进行了综述，这些药物可以通过激活Nrf2及其下游因子起到心肌保护作用。但是，这些药物研究大多是在动物及细胞实验中，在临床研究及实践中报道甚少。过度激活Nrf2/ARE信号通路会增加糖尿病心肌病及癌症的多重耐药性。如水果蔬菜，它们具有某些抗氧化物质，激活Nrf2的浓度可能不高，但是绿茶提取物和纯化的没食子酸酯可能就会过度激活Nrf2/ARE信号通路。所以，加强Nrf2激活剂的研究，使其效果确切，减少不良反应，从动物实验逐渐应用于临床，有望成为减轻糖尿病MI/RI的重要策略之一。
如果您对本文感兴趣，可登录我刊投稿系统平台（