在中国及全世界范围内,心肌梗死是导致死亡的主要原因。临床上已有经皮冠状动脉介入、冠状动脉旁路移植术、抗血小板和抗凝药物等治疗方法可实现心肌的再灌注,梗塞的冠状动脉可以很快再通,但在缺血心肌再灌注后,它依然有可能出现心脏功能恶化和心肌损伤,这种遭受一定时间缺血的组织或细胞恢复血流(再灌注)后,组织损伤程度迅速增剧的现象称为缺血/再灌注损伤(I/R)。I/R造成的心肌梗死面积可占到总梗死面积的一半,因此,深入了解缺血/再灌注损伤的发生机制至关重要。
I/R的分子机制非常复杂,包括心肌细胞死亡、血管功能障碍、一氧化氮(NO)生物利用度降低、活性氧(ROS)和活性氮(RNS)生成、线粒体功能障碍和炎症等。其中,内皮型一氧化氮合酶(eNOS)产生的一氧化氮(NO)可以防止心肌缺血再灌注损伤。eNOS作为合成NO的限速酶,其活性的改变会影响NO的生成。eNOS只有在二聚体时才具有活性,当机体在氧化应激时,eNOS发生谷胱甘肽化后修饰(glutathionylatedeNOS,SG-eNOS)而解偶联,SG-eNOS催化生成大量超氧阴离子(O2.-),NO生成减少,造成NO生物活性下降,这是缺血再灌注损伤的一个重要机制。目前,尚不清楚SG-eNOS在体内是如何被调控的。
年9月22日,美国德克萨斯理工大学KumudaCDas教授团队在CirculationResearch上发表了题为“Chaperone-MediatedAutophagyofeNOSinMyocardialIschemia-ReperfusionInjury”的研究论文,确定了SG-eNOS通过分子伴侣介导的自噬(CMA)途径降解。同时,该研究发现,在再灌注早期使用Trx诱导SG-eNOS去谷胱甘肽化可使eNOS重新恢复功能,进而促进NO生成,减轻心肌再灌注损伤。
首先,研究者分析了缺氧/复氧(H/R)时人冠状动脉内皮细胞中eNOS与SG-eNOS水平的变化,发现eNOS水平逐渐下降,SG-eNOS水平逐渐上升。同时,研究者还发现eNOS的mRNA水平无明显变化,提示eNOS翻译后S-谷胱甘肽化修饰可能诱导其降解。为了进一步确定SG-eNOS的降解途径,研究者给予细胞不同的抑制剂处理,如蛋白酶体抑制剂MG、大自噬抑制剂3-MA或溶酶体抑制剂CQ等,确定了SG-eNOS通过溶酶体途径降解而非蛋白酶体途径降解。由于大自噬和分子伴侣介导的自噬(CMA)是真核生物中两种主要的自噬降解过程,研究者接下来通过敲低大自噬关键基因ATG5及CMA关键基因HSC70或LAMP2进一步明确了SG-eNOS通过CMA途径降解。
为了进一步阐明SG-eNOS经CMA途径降解的过程,研究者将eNOS中两个关键的谷胱甘肽化位点C和C残基进行突变,并通过在人冠状动脉内皮细胞中转染野生型质粒和突变质粒,发现C和C位点突变后eNOS失去了与CMA过程中运输蛋白HSC70相结合的能力,也难以进入溶酶体降解。这些结果表明,HSC70与谷胱甘肽化相关的特定半胱氨酸残基相互作用,eNOS的谷胱甘肽化修饰是其经CMA途径降解的前提。进一步研究发现,使用巯基还原剂Thioredoxin(Trx)后,SG-eNOS发生去谷胱甘肽化,eNOS经CMA途径降解减少,eNOS和NO水平得以恢复。
含有KFERQ序列是CMA底物的典型特征,底物中的KFERQ序列也是其与HSC70的结合位点。研究者分析了eNOS的氨基酸序列并发现,eNOS在上述Cys附近存在两个KFERQ序列,分别是ERLLQ和QRYRL。通过对这两个KFERQ序列进行突变、转染以及Co-IP,进一步确定了QRYRL序列是eNOS与HSC70的结合位点。这些研究阐明了eNOS经CMA途径降解的大致过程:eNOS在Cys位点发生谷胱甘肽化,促使QRYRL序列暴露,进而与HSC70结合并被运输到溶酶体降解。
最后,研究者构建了Trx-Tg转基因小鼠,发现与WT小鼠相比,暴露于I/R的Trx-Tg小鼠未出现eNOS水平下降或SG-eNOS水平升高,并且Trx-Tg小鼠心肌灌注损伤明显改善,这些改变是由于Trx使SG-eNOS发生去谷胱甘肽化并抑制其CMA降解、eNOS水平恢复和NO产生增加导致的。
本项研究表明,在I/R再灌注心肌中,SG-eNOS通过CMA途径降解,导致eNOS的不可逆损失,造成NO产生不足。去谷胱甘肽可以有效地挽救I/R中eNOS的降解,从而恢复NO生成、改善心肌组织灌注损伤。在再灌注早期通过重组Trx蛋白或NAC诱导eNOS去谷胱甘肽化可减轻再灌注损伤,减少心肌梗死面积。该研究不仅确定了CMA介导的eNOS自噬在心肌缺血再灌注损伤中的作用,还证实了去谷胱甘肽化剂可以逆转再灌注过程中eNOS的损失,从而对心肌起保护作用,为治疗缺血再灌注损伤提供了新的思路。
该研究论文的第一作者是美国德克萨斯理工大学的JaganathanSubramani,KumudaCDas教授为本文的通讯作者。
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