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来源于《中国中药杂志》，网络首发日期：-05-26
基于HIF-1信号通路研究芪参益气滴丸
治疗心肌缺血的分子机制
龚燚婷1，李彦萍1，程亚茹2，石秀佳1，杨丽1，杨东平1，徐文娟2通讯作者，董玲1通讯作者
(1.北京中医药大学中药学院，北京;2.北京中医药大学生命科学学院，北京)
芪参益气滴丸由*芪、丹参、三七、降香组成，“君药”*芪补气益表，“臣药”丹参活血祛瘀，“佐药”三七化瘀止血，“使药”降香行气活血；诸药合用具有益气通脉、活血止痛的功效，临床上常用于治疗气虚血瘀型冠心病，冠心病是冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起血管腔狭窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病，目前已有大量药效研究表明芪参益气滴丸对心肌缺血大鼠有显著疗效，能改善缺血引发的心脏微循环障碍、心肌损伤等，然而其抗心肌缺血的潜在活性成分群、分子机制尚未完全明确。此外，由HIF（低氧诱导因子）及其所在的HIF-1信号通路调控的动物细胞对氧气的感知和反应亦是重要的生理过程，在心血管疾病病理生理学中占有重要地位，但目前芪参益气滴丸对HIF-1信号通路上相关蛋白调控作用的研究尚有欠缺，填补此研究领域的空白有利于进一步完善芪参益气滴丸治疗心肌缺血的分子机制。
中药作用于人体发挥药效是中药与人体2个复杂体系间的相互作用，通过多成分、多靶点的综合效应起到防病治病作用，网络药理学可在分子水平上阐明成分-成分网络、成分-靶点网络以及靶点-疾病网络之间的协同效应和潜在机制，系统反映中药多成分、多靶点作用关系，故对于解析中药复方于人体发挥药效的潜在活性成分和分子机制具有关键作用。此外，对心肌细胞实施糖氧剥夺的糖氧剥夺细胞模型可良好模拟心肌缺血的病理状态，目前已广泛运用于心肌缺血领域药效研究。
故本研究拟以网络药理学为基础，开展芪参益气滴丸治疗心肌缺血的分子机制研究；然后结合糖氧剥夺模型展开药理及分子生物学验证实验，基于特征通路阐明复方治疗心肌缺血的分子机制。
1材料
1.1细胞
H9C2大鼠胚胎心肌细胞购自北京协和细胞库。
1.2药物与试剂
药物：丹参素对照品（批号H25S8X，上海源叶生物科技有限公司）；*芪甲苷对照品（批号J25F10T，上海源叶生物科技有限公司）；人参皂苷Rg1对照品（批号G30N10Y，上海源叶生物科技有限公司）；橙花叔醇对照品（批号KJCA14，上海源叶生物科技有限公司）。
试剂：DMEM培养基（货号CBT，美国invitrogen公司）；青链霉素双抗（PS，货号，美国invitrogen公司）；胎牛血清（FBS，货号，美国invitrogen公司）；PBS（货号P-5X10PAK，美国Sigma公司）；0.25%胰酶（TE，货号，美国invitrogen公司）；LDH乳酸脱氢酶试剂盒（货号A-2-2，中国南京建成生物工程研究所）；HIF-1α（货号16H4L13，美国ThermoScientific公司）；AKT1（货号#，美国Cellsignaling公司）；PIK3CA（货号#，美国Cellsignaling公司）；VEGFA（货号ab，英国abcam公司）；β-tubulin（货号-1-Ig，美国Proteintech公司）。
1.3仪器
HERAcellviosiCO2培养箱（美国ThermoScientific公司）；CKX53倒置光学显微镜（日本Olympus公司）；SERIESA2生物安全柜（美国ThermoScientific公司）；Spectramaxi3x酶标仪（美国MolecularDevices公司）；R冷冻离心机（德国Eppendorf公司）。
2方法
2.1基于网络药理学研究芪参益气滴丸治疗心肌缺血的配伍机制
2.1.1收集复方活性成分靶点与心肌缺血疾病蛋白
通过文献收集复方入血成分，并将之作为活性成分进行靶点的采集。利用PubMed数据库与中药系统药理数据库（TCMSP）收集并整理活性成分的靶点信息，利用UniProt数据库校正蛋白名称；使用Swisstargetprediction数据库补充活性成分作用靶点，进而构建芪参益气滴丸活性成分靶点数据库。
利用人类孟德尔遗传数据库（OMIM）、疾病相关的基因与突变位点数据库（DisGeNET）、人类疾病数据库（MalaCards），以“myocardialischemia”为关键词，收集心肌缺血相关的人类疾病基因，构建心肌缺血疾病靶点数据库。
2.1.2PPI数据采集与网络构建分析
String数据库能获得可能的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI），包括直接的物理关联和间接的生物关联。本研究中PPI数据皆源于String数据库，筛选条件为score0.4。将PPI数据导入Cytoscape软件，构建“活性成分靶标-疾病蛋白”交互网络。计算所有节点的Degree值，选择网络中Degree值大于二倍中位数的节点作为网络的中心。计算中心网络的3个拓扑参数（degree、betweenness、closeness），选择拓扑值大于中位数的节点作为网络的关键枢纽，即联系活性成分靶点和疾病蛋白之间的关键靶点。
2.1.3GO和KEGG富集分析
使用David6.8数据库对关键靶点进行GO功能注释与KEGG通路富集分析，以P0.05进行筛选，获得芪参益气滴丸活性成分在治疗心肌缺血时发挥作用的相关分子功能和重要通路。
2.2基于H9C2细胞糖氧剥夺模型的体外药效验证
2.2.1细胞培养与模型建立
细胞培养：大鼠胚胎心肌细胞H9C2在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中培养，另加入1%青霉素-链霉素，置于37℃，5%CO2的培养箱中培养。在细胞融合度约为80%时传代，所有试验的细胞均在15代以内。
糖氧剥夺模型建立：细胞造无糖无血清的DMEM培养基中培养，置于37℃，5%CO2，94.2%N2，0.8%O2的培养箱中培养，若细胞出现大量漂浮，细胞活性为50%，则模型建立成功。
2.2.2CCK-8法检测细胞生存活力
取对数生长期的H9C2细胞，0.25%胰酶消化，r·min-1离心4min收集细胞，加培养液并调整其浓度为1×个/mL，以每孔μL接种于96孔培养板中培养24h。实验设置空白组、模型组、对照组和不同浓度给药组，空白组、模型组和对照组给予μLDMEM无血清培养基。给药组分别给予等体积的浓度为、50、20、5、1μmol·L-1的活性成分，每组设5个复孔，置于5%CO2的培养箱中37℃正常培养36h。吸取培养基上清液，弃去，模型组和给药组糖氧剥夺培养，对照组正常培养。吸取培养基上清液，弃去，在避光条件下，每孔加入含10%CCK-8的培养基μL，于培养箱中孵育2h，用酶标仪检测nm波长的吸光度。实验重复3次。细胞生存活力=(A药物处理组－A空白)/(A对照组－A空白)
2.2.3细胞上清液LDH活力检测
浓度为、50、20、5、1μmol·L-1的药物处理H9C2细胞36h后糖氧剥夺培养，每组设5个复孔，吸取培养基上清液，按LDH试剂盒说明书检测LDH活力。实验重复3次。
2.2.4Westernblot法检测蛋白表达
浓度为、50、5μmol·L-1的药物处理H9C2细胞36h后糖氧剥夺培养，弃去上清液，每孔加入μL含2%蛋白酶抑制剂的预冷RIPA溶液，反复重悬，转移至预冷的1.5mLEP管中，4℃、00r·min-1离心20min，收取上清液蛋白，采用BCA定量试剂盒测定蛋白浓度。制备12.5%SDS-PAGE凝胶，取10μg蛋白，加入loadingbuffer（6×），95℃5min变性后，离心，聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿法转膜，5%脱脂牛奶室温封闭1h，加入相应抗体HIF-1α、AKT1、PIK3CA、VEGFA及β-tubulin，4℃孵育过夜，TBST漂洗3次，每次8min，加入相应的二抗（稀释1：0），室温封闭孵育1h，TBST漂洗3次，每次8min，加入ECL显色，于凝胶成像系统下成像，用ImageJ软件进行半定量分析。实验重复3次。
2.2.5数据分析
采用SPSS16.0软件包分析数据，各项数据均以`x±s示，其中多组间差异比较采用单因素方差分析(One-wayANOVA),P0.05差异有统计学意义。
3结果
3.1芪参益气滴丸“活性成分-靶点-通路”网络构建与分析
3.1.1复方活性成分和心肌缺血疾病的靶点收集
依据文献筛选复方中的18种入血成分，详见表1。利用TCMSP数据库和Swisstargetprediction数据库收集活性成分的作用靶点，合并去重后获得个潜在靶点。通过OMIM、DisGeNET、MalaCards数据库，分别以“myocardialischemia”为关键词检索到49、、个疾病基因，合并去重后共获得个疾病蛋白，见表1。
3.1.2活性成分靶点-疾病蛋白相互作用网络构建与分析
为了探明芪参益气滴丸活性成分治疗心肌缺血的分子机制，利用String数据库结合Cytoscape软件构建活性成分靶点-疾病蛋白PPI网络（nodes，edges）。依次以①degree60，②degree93、betweenness.、closeness0.为筛选条件，对网络节点进行2次筛选，最终获得82个节点作为活性成分靶点-疾病蛋白网络关键靶点，见图1。其中白蛋白（ALB，原儿茶酸调控），肿瘤坏死因子（TNF，隐丹参酮、芒炳花苷调控），肿瘤蛋白p53（TP53，丹参酮IIA、毛蕊异*酮调控），丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AKT（AKT1，*芪甲苷调控），血管内皮生长因子A（VEGFA，*芪甲苷、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1和三七皂苷R1共同调控）在整个活性成分靶点-疾病蛋白网络中起重要作用。
3.1.3GO功能注释和KEGG通路富集分析
为阐明“活性成分靶标-疾病基因网络”关键靶点的生物学功能，利用David数据库进行GO功能注释与KEGG通路富集分析。GO功能注释结果显示，这些靶点能够调节有机体的多种生物过程，包括一氧化氮生物合成、细胞凋亡、脂多糖反应、炎症反应、细胞增殖、血管生成等，见图2A。KEGG通路富集结果显示，芪参益气滴丸活性成分可通过调节TNF信号通路、HIF-1信号通路、PI3K-Akt信号通路等以调节机体炎症反应、血管生成与扩张、厌氧代谢、细胞增殖和凋亡等多种生理功能，进而发挥治疗心肌缺血功效，见图2B。利用Cytoscape软件构建“活性成分-靶点-通路”的整体网络，可视化芪参益气滴丸调控有机体的生物过程，见图2C。
3.2基于HIF-1信号通路分析复方治疗心肌缺血的分子机制
基于前期收集的活性成分潜在靶点，利用DAVID数据库进行单味药材的KEGG通路富集分析，见表2~5。结果表明*芪、丹参、三七共有9个共同通路（P0.05），见图3，其中HIF-1signalingpathway、PI3K-Aktsignalingpathway、rassignalingpathway和rap1signalingpathway与心肌缺血密切相关。由于HIF-1信号通路是有机体的低氧应激通路，在低氧下能迅速被激活以保护心肌细胞，且芪参益气滴丸及组方药材*芪、丹参和三七均通过HIF-1信号通路发挥疗效，故HIF-1信号通路应为复方治疗心肌缺血的特征通路，本研究基于HIF-1信号通路阐释复方治疗心肌缺血的分子机制。
芪参益气滴丸调控的HIF信号通路图见图4，以HIF-1α为核心整理复方中与HIF-1α基因表达密切相关的靶点可知，芪参益气滴丸复方中的活性成分可协同调控HIF-1信号通路中的关键靶点，以整体调控HIF-1信号通路，发挥促进血管生成、血管扩张、抑制厌氧代谢等生理过程发挥保护心肌细胞的作用，如三七和*芪则能共同作用于VEGFA靶点，协同促进血管生成过程。
3.3基于H9C2细胞糖氧剥夺模型的药效验证
3.3.1H9C2细胞糖氧剥夺模型的建立
为建立适宜的模型进行药效验证实验，对细胞的缺氧缺糖时间进行考察。将H9C2细胞分别置于37℃，5%CO2，94.2%N2，0.8%O2的培养箱中，缺氧缺糖培养4、6、8h。当细胞缺氧缺糖时间为6h时，细胞的生存活力约为50%较为适宜，见图5，故将其作为模型的缺氧缺糖时间。
3.3.2CCK-8法检测细胞活性
通过文献研究得知，复方18个活性成分中，*芪甲苷、丹参素、人参皂苷Rg1、橙花叔醇在*芪、丹参、三七、降香油中含量较高，故初步选择此4种成分进行糖氧剥夺模型的体外药效验证。
首先通过CCK法考察成分对糖氧剥夺下H9C2细胞生存活力的影响。*芪甲苷、丹参素、人参皂苷Rg1在浓度0~50μmol·L-1可浓度依赖性增强糖氧剥夺下细胞的活性，橙花叔醇则在此浓度范围下无显著作用，见图6，该结果和网络药理学结果相一致。
3.3.3细胞上清液LDH活力试验
依据CCK实验结果选择*芪甲苷、丹参素、人参皂苷Rg1检测LDH活力。这3个成分可显著降低糖氧剥夺下细胞上清液中LDH的活力（P0.05），且呈现浓度依赖性。当细胞损伤时，LDH会从破损的细胞中流入细胞外的基质中，LDH活性实验结果表明，此3个成分可浓度依赖性降低糖氧剥夺下心肌细胞损伤，见图7。
3.3.4Westernblot检测HIF-1信号通路蛋白表达
药理研究表明，*芪甲苷、丹参素、人参皂苷Rg1能显著提高糖氧剥夺H9C2细胞的生存活力，降低细胞损伤；网络药理学研究表明，HIF-1信号通路是其发挥活性的特征通路。故本研究利用Westernblot实验进一步考察*芪甲苷、丹参素、人参皂苷Rg1对HIF-1信号通路蛋白的调控作用，验证复方基于HIF-1信号通路治疗心肌缺血的配伍机制。Westernblot实验结果见图8，*芪甲苷能显著调控AKT1、HIF-1α、VEGFA蛋白表达（P0.05），且呈浓度依赖性，其中*芪甲苷能够显著下调糖氧剥夺细胞AKT1和HIF-1α的蛋白表达（P0.05），抑制HIF-1信号通路；显著上调VEGFA蛋白的表达（P0.）。丹参素能在5~μmol·L-1浓度范围内浓度依赖性的下调AKT1上游蛋白PIK3CA的表达（P0.），下调HIF-1α蛋白表达（P0.01），进而抑制HIF-1信号通路。人参皂苷Rg1能下调HIF-1α蛋白表达的同时，上调VEGFA蛋白的表达（P0.01）。因此，*芪甲苷、丹参素、人参皂苷Rg1能有效抑制HIF-1信号通路上的AKT1、PIK3CA、HIF-1α的表达，尤其是HIF-1α的蛋白表达，进而抑制HIF-1信号通路，以保护心肌细胞。
4讨论
芪参益气滴丸源于中医药理论指导下的临床实践，是临床经验方，其治疗心肌缺血疾病的临床功效显著，但人们对该复方药效机制的认识尚存诸多空白，制约其科学临床应用及现代化发展。本研究以网络药理学为基础，系统阐释芪参益气滴丸调控的关键靶点和特征通路，构建“活性成分-关键靶点-特征通路”的整体网络；利用糖氧剥夺模型进行生物学验证，基于特征通路出发阐明成分群的调控规律与配伍关系，有利于阐明复方整体配伍科学内涵；理论指导实践，有利于指导复方科学临床应用。心肌缺血时，厌氧代谢代替葡萄糖代谢和脂肪代谢成为心肌细胞主要代谢途径，导致三磷酸腺苷（ATP）合成大量减少。ATP可将单个的细胞骨架（Gactin）组装成肌动蛋白F-actin，它是心肌细丝和粗丝的亚结构，可用于维持心肌收缩和舒张功能进而发挥行血的作用，ATP减少将导致肌动蛋白F-actin解聚为G-actin，引发了心肌细胞细丝和粗丝的降解，心肌纤维断裂和心功能降低。此外，大量厌氧代谢产生的H+将导致细胞酸中*，进一步损伤心肌细胞，因此心肌缺血损伤的本质是血管栓塞后细胞的能量异常代谢。为探究芪参益气滴丸组方药材的生物功能及配伍机制，分别对各药材进行GO和KEGG富集分析：心肌代谢能量的来源主要是脂肪酸和葡萄糖氧化提供的ATP等高能磷酸键，富集分析结果表明，*芪可通过调控脂质代谢、葡萄糖代谢、ATP结合等过程，促进线粒体内ATP的生成和利用，综合调节缺氧细胞的能量代谢过程，进而发挥“益气”的传统功效，其分子机制可能与AMPK信号通路、Jak-STAT信号通路有关；抑制血小板活性已成为预防心肌缺血疾病的有效治疗策略，目前磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）被公认为血小板活化多个步骤的关键参与者，MAPK途径与蛋白激酶C（PKC）则参与控制血小板黏附、聚集等功能过程，富集分析结果表明，丹参可通过参与PLCγ-PKC，PI3K-Akt和MAPK途径介导的信号传导机制，综合调控血小板活性，进而发挥“活血化瘀”功效。故二者合用，再配以活血药三七和降香，可有效治疗心肌缺血疾病。
同时，本研究还发现HIF-1信号通路是复方治疗心肌缺血的特征通路。HIF-1信号通路是生物处于低氧状态下的应激信号通路，可通过调节HIF-1α的功能以保护心肌：在缺氧条件下，HIF-1α会不断累积并与HIF-1β形成二聚体，并在核内与辅因子CBP/p和RNA聚合酶II（PolII）复合物等相互作用，激活下游VEGFA、人内皮素1（EDN1）、一氧化氮合成酶2（NOS2）等靶基因的转录，促使血管内皮细胞分裂增殖及诱导血管生成再生、促进细胞厌氧代谢等作用，提高ATP的合成，维持心肌细胞功能。然而在缺氧条件下，HIF-1α过表达会过高的促进细胞厌氧代谢，造成细胞能量代谢紊乱，进而破坏心肌细胞。本研究基于HIF-1信号通路研究芪参益气滴丸的配伍机制，发现丹参素、*芪甲苷能分别下调PIK3CA、AKT1蛋白表达，*芪甲苷、丹参素、人参皂苷Rg1能共同作用于HIF-1α靶点，下调缺氧下细胞内HIF-1α蛋白的过表达，以增强细胞生存活力，降低细胞损伤，实现保护心肌细胞的作用。此外，VEGFA具有增加微、小静脉血管的通透性，促使血管内皮细胞分裂增殖及诱导血管生成再生等作用，人参皂苷Rg1和*芪甲苷能直接上调VEGFA的蛋白表达，促进缺血组织侧支循环的形成，从根本上改善心肌血供问题。
综上，本研究基于网络药理学初步明确了芪参益气滴丸的18种活性成分和82个关键靶点，并对其进行功能注释和通路富集，初步阐明了复方整体治疗心肌缺血的分子机制。基于特征通路初步研究了复方治疗心肌缺血的分子机制并加以药效验证，发现复方中的活性成分能抑制糖氧剥夺心肌细胞中HIF-1α蛋白的过表达以抑制HIF-1信号通路，保护心肌的靶点，为复方在有机体相互作用的整体效应研究与配伍机制研究提供基础。
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