乙醛脱氢酶2(ALDH2)在调节线粒体稳态中具有关键作用，我们利用ALDH2激活剂Alda-1处理后移植探索其治疗作用。研究发现心肌细胞时间依赖性摄取外源线粒体。Alda-1刺激显著提高线粒体移植引起的心肌细胞呼吸及机械功能，同时抑制缺氧-复氧暴露诱导的心肌细胞凋亡。Alda-1处理的线粒体移植到I/R小鼠心肌可以显著降低I/R损伤后梗死的大小。
01
研究内容简介
近年来我国缺血性心血管疾病的发生率和死亡率一直呈现显著上升的趋势。心肌缺血导致的心肌细胞死亡是心肌损伤的主要原因，因此逆转或延缓心肌细胞压力应激下的损伤是缓解缺血性心血管疾病发生发展的重要环节。以往的干细胞移植策略以期望实现心肌再生的蓝图遇到了前所未有的瓶颈。并且目前的药物治疗也尚不能有效逆转心肌损伤。因此，寻找可替代的新型治疗措施是改善心血管疾病的重要方向。鉴于线粒体功能障碍是缺血性心血管疾病进展的主要驱动因素，此过程中给予线粒体移植补充心肌产能有望缓解心肌损伤，可成为治疗缺血性心血管疾病的重要手段。但是线粒体移植在心血管领域的研究相对比较空白，目前国际上的研究证实了线粒体移植的安全有效性，在提高移植线粒体的质量和治疗效果方面仍存在许多挑战。
我们首先对心肌细胞摄取外源线粒体的可行性及动态过程进行了分析，研究结果发现心肌细胞时间依赖性摄取外源线粒体，并且随着线粒体摄入的增加，心肌细胞的产能逐渐增加（图1）。
图1心肌细胞摄取外源线粒体的动态过程。
A)和B)流式细胞术分析H9c2细胞中MitoTracker绿色标记线粒体的内化情况。
C)和D)成年小鼠心肌细胞活细胞成像动态分析绿色标记线粒体细胞摄入情况。标尺，μm。
E)线粒体移植3小时(绿色)和H9c2细胞(红色)共定位的荧光成像。标尺，25μm。
F)H9c2细胞在线粒体移植后0、1、3、6h产生的ATP水平。
G)线粒体(绿色)移植3小时后和成年小鼠心肌细胞(红色)共定位的荧光成像图。标尺，25μm。
H)线粒体移植0、1、3、6小时后H9c2细胞培养液中ATP检测。
乙醛脱氢酶2(ALDH2)是线粒体保护分子，在线粒体代谢和功能调节中发挥重要作用，Alda-1激活线粒体ALDH2可以显著增强心肌细胞的线粒体代谢产能。我们当前的研究应用ALDH2激活剂Alda-1修饰线粒体研究其对线粒体移植的潜在治疗作用。研究结果表明：Alda-1刺激显著提高线粒体移植引起的心肌细胞耗氧率和机械收缩舒张功能（图2）。
图2ALDH2激活后的线粒体移植显著增强呼吸介导的心肌细胞机械收缩与舒张功能。
A)正常和不同ALDH2活性线粒体移植6小时后心肌细胞产生的ATP水平。
B)不同线粒体移植6h后心肌细胞OC值的R变化。
C)通过OCRpre-Olig-OCRpre-anta计算出的心肌细胞基础呼吸率。
D)心肌细胞的静息长度。
E)最大缩短速度(-dl/dt)。
F)峰值缩短时间(TPS-ms)。
G)峰缩短(%细胞舒张长度)。
H)心肌细胞舒张最大速度(+dl/dt)。
I)细胞长度缩短到90%时的时间(TR90-ms)。
体外研究构建了缺氧再复氧诱导的心肌细胞损伤模型，并实施不同的线粒体移植，研究结果证实Alda-1刺激后的线粒体移植抑制缺氧再复氧诱导的心肌细胞凋亡（图3），并显著增强缺氧再复氧后心肌细胞的机械反应（图4）。
图3ALDH2活化后的线粒体移植可改善缺氧再复氧引起的心肌细胞损伤。
A)缺氧(45min)-复氧(3h)处理诱导并实施不同线粒体移植后心肌细胞凋亡水平的荧光成像。细胞核染色DAPI(蓝色)。红色代表凋亡的心肌细胞。比例μm。
B)心肌细胞凋亡水平的统计学差异。
C)Westernblot检测不同组间活化的caspase-3水平。
D)缺氧再复氧刺激心肌细胞后，不同ALDH2活性背景的线粒体移植后的细胞形状(明场)和线粒体ROS水平变化(红色荧光)。比例尺，μm。
E)缺氧再复氧刺激心肌细胞后，不同ALDH2活性背景的线粒体移植后的细胞线粒体水平代表性图像。细胞核染色Hoeschst(蓝色)。绿色代表移植的线粒体。红色代表受体心肌细胞中的线粒体。比例尺，20μm。
图4不同ALDH2活性背景线粒体移植对缺氧-复氧刺激后的心肌细胞机械功能的影响。
A)缺氧-复氧刺激和线粒体移植(有无Alda-1处理)后心肌细胞OCR变化。
B)心肌细胞基础呼吸的计算。基础呼吸定义为OCRpre-Olig-ocrpre-Anta。
C)静息细胞长度。
D)最大缩短速度(-dl/dt)。
E)峰值缩短时间(TPS-ms)。
F)峰缩短(%细胞舒张长度)。
G)心肌细胞舒张的最大速度(+dl/dt)。
H)舒张到90%细胞长度的时间(TR90-ms)。
进一步的在体研究通过构建小鼠的心肌缺血再灌注损伤模型，实施不同ALDH2活性的线粒体心肌原位注射移植，动物水平验证Alda-1刺激对线粒体移植治疗缺血再灌注损伤的效果及相关机制，研究结果表明，Alda-1修饰的线粒体移植通过抑制心肌细胞凋亡显著改善小鼠心肌缺血再灌注损伤后的心功能，降低心肌的梗死面积（图5）。
图5Alda-1修饰后的线粒体移植显著改善小鼠I/R损伤。
A)小鼠超声心动图分析:C(假手术组，n=5)、I(I/R损伤组，n=9)、M(I/R损伤+线粒体移植组，n=10)、A(I/R损伤+ALDH2激活的线粒体移植组，n=11)。
B)小鼠心肌射血分数和C)短轴缩短率。
D)伊文思蓝色染色和TTC染色代表性图像，移植的线粒体(粉红色荧光，标尺，μm)和阳性TUNEL染色(绿色荧光，标尺，50μm)。
E)ALDH2激活和正常线粒体移植导致的小鼠心肌梗死面积变化。危险面积(AAR)表示左室缺血面积的百分比。IR,n=10;Mito,n=9;Alda-1,n=7。
F)代表性不同线粒体移植后的心肌荧光成像图，代表心脏移植线粒体在心肌驻留情况(红色荧光)。
G)移植线粒体的平均荧光强度。IR,n=3。Mito,n=4。Alda-1,n=6。
H)和I)Westernblot分析凋亡蛋白cleaved-caspase3d的表达变化。
综上，该研究对缺血再灌注损伤心肌实施修饰后的线粒体移植，第一次证实线粒体保护分子ALDH2参与线粒体移植的重要作用。经Alda-1激活线粒体ALDH2可以显著增强心肌细胞的线粒体代谢产能，结合线粒体移植的离体和在体研究证实了ALDH2激活后的线粒体移植能够有效改善心肌缺血再灌注损伤（图6）。因此提出ALDH2活化是增强线粒体移植治疗心肌缺血再灌注损伤的有效干预手段，具有很重要的临床应用价值。鉴于ALDH2基因突变的亚洲人群分布多态性，针对于不同的ALDH2基因型病人实施线粒体移植时，研究结果具有重要的临床指导意义。
图6研究概览
02
论文第一/通讯作者简介
第一作者：孙晓垒
博士、医院，研究方向为线粒体动力学与代谢参与心功能调控的机制研究。
第一作者：高日峰
博士、复旦大学附医院，研究方向为心肌能量代谢与免疫微环境参与心脏重构调控的机制研究。
第一作者：李文佳
博士、医院，研究方向为线粒体能量代谢与心力衰竭。
通讯作者：孙爱*
博士、医院教授、博士生导师。研究方向：心肌保护与能量代谢,以通讯或第一作者在Circulation,Circulationresearch,NatCommun,ATVB等发表SCI论文50余篇。主持包括国家自然科学基金、国家“”子课题等10余项基金。
通讯作者：葛均波
医院教授，中科院院士，长江学者，博士生导师。长期致力于冠状动脉疾病诊疗策略的优化与技术革新。先后承担了20余项国家和省部级科研项目，作为通讯作者发表SCI或SCI-E收录论文余篇。作为第一完成人获得国家科技进步二等奖等10余项科技奖励。
03
资助信息
上述研究工作得到了国家杰出青年科学基金（817010），中国自然科学基金（81521,）及中国博士后面上基金（M）支持。
04
原文信息
XiaoleiSun#,RifengGao#,WenjiaLi#,YongchaoZhao,HengYang,HangChen,HaoJiang,ZhenDong,JingjingHu,JinLiu,YunzengZou,AijunSun*,JunboGe*.
Alda-1TreatmentPromotestheTherapeuticEffectofMitochondrialTransplantationforMyocardialIschemia-ReperfusionInjury.
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