专注于应用基因编辑小鼠模型，探讨基因与心脏功能影响作用的基础研究，赛业生物首席科学家俞晓峰博士最近对首都医科大学罗大力教授进行了特邀访谈，请罗教授基于她最近在此研究领域发表的相关成果，从提出研究项目相关假设，选择候选基因及建立相关基因编辑小鼠疾病模型，到解析相关基因与心脏疾病致病作用机制等方面进行深入解读，以帮助我们更好了解与学习模式动物基础研究中的经典思路与策略，为今后基因功能相关的模式动物基础研究工作，提供有价值及实际应用的参考意义。
本专访是基于罗老师最近在发表在Circulation和CellDeathDifferentiation期刊上的相关文章为基础，抛砖引玉出相关问题，以求共同探讨交流与学习。
俞晓峰博士：根据集钙蛋白（Casq1）基因不同组织表达特征，该基因在人体骨骼肌中表达量较高，而在心脏组织转录水平很低，蛋白表达未见报道，罗老师为什么会选择将该基因敲除在心脏组织特异性敲除的策略，评价基因缺失对心脏功能的影响作用？
罗大力教授：首先感谢赛业生物为我们构建了高效精准的基因模式动物，使我们能够从动物整体水平系统研究关键蛋白的功能。
集钙蛋白是肌浆网钙贮存蛋白，使肌细胞在兴奋时有效释放出游离的钙离子进入胞浆，产生肌肉收缩。已发现二种集钙蛋白亚型，1型和2型（Casq1和Casq2）。哺乳动物的Casq1主要表达在骨骼肌，而Casq2只表达在心肌，二者均与人类遗传疾病密切相关。Casq1缺失可引起骨骼肌损伤和高热，即恶性高热病（MH），Casq2缺失可致儿茶酚胺多形性室性心律失常（CPVT）。有趣的是在已报道的大量MH患者中除骨骼肌症状外，也发生心动过速和室性心律失常，但病生理的机理并不清楚。我们在前期研究糖尿病心肌病时偶然发现动物心脏除表达Casq2外，也表达Casq1亚型。因此，令我们想到MH的心脏问题是否与这个心脏表达的Casq1有关？心肌细胞的结果使我们有信心进一步构建了心脏特异性Casq1敲除鼠进行系统性Casq1在心脏的功能和病理意义的研究。
俞晓峰博士：罗老师应用我们构建的Casq1条件性打靶（floxed）小鼠模型，不仅用该floxed小鼠与心脏特异性表达Cre小鼠交配繁殖，以研究Casq1基因在心脏组织敲除后对心脏功能损伤的影响及其作用机制。同时，还用该floxed小鼠与全身表达Cre小鼠交配繁殖，实现全身敲除Casq1基因的目的，通过对不同敲除策略小鼠模型的比较研究，罗老师能否分享一下从中获得了哪些不一样的发现或意外收获？
罗大力教授：我们认为做基础研究最重要的使命是解决临床中发现的问题，为临床未知的疾病或疾病发生的病生理机制提供理论基础和有效的治疗思路和策略。患者发生基因遗传性疾病是影响全身该基因相关蛋白的表达进而发挥功能。因此，构建心脏条件性基因模式动物以排除骨骼肌Casq1改变的影响同时，再制备全身性Casq1敲除鼠模拟人类的病理状态对解决相关疾病的病生理机制具有重要的支持作用。
有意义的是全身和心脏条件性Casq1基因敲除鼠在心脏的疾病表型完全相似，甚至心脏条件性敲除鼠的心律失常症状更为严重，说明MH的心脏症状与骨骼肌损伤无关（目前认为MH心动过速和室性心律失常与骨骼肌损伤释放的大量酸性产物，炎性因子和自由基有关），而是由于心脏的Casq1蛋白表达减少直接造成的。
俞晓峰博士：我们注意到，罗老师在研究中通过应用药物（比如2%异弗烷麻醉剂），或41℃高温来诱导Casq1敲除小鼠模型，构建相应的小鼠疾病模型，研究该基因对心脏功能的影响作用。是不是可以理解为，如果没有这些诱导因素的参与，只是Casq1基因的敲除，很难观察到明显表型改变？能否分享一下你们如此设计实验的想法与依据？
罗大力教授：临床患者发生MH或CPVT都是在特定条件下；MH经常是在气体麻药使用中或高温环境，或剧烈的运动条件下发生，CPVT是在激烈运动条件下发生。因此，我们模拟临床症状诱导环境（麻药或高热）产生完全相似的表型，说明Casq1在MH发生中的关键作用。作为基础研究工作者，更重要的是回答和解决为什么通常情况下没有症状，需在这些诱导因素存在的条件下发生致命性心律失常，由于突然发生而不能快速而有效救治，其死亡率高达90%。通过研究我们发现在2种Casq1敲除鼠，Casq1蛋白的多聚体表达轻度减少，而单体，二聚体/三聚体下调非常明显。在麻药和高温条件下Casq1多聚体解聚成单体/二聚体/三聚体，最终使Casq1整体水平更加减少是MH心脏表型的病理生理基础。说明Casq1生理功能主要是通过多聚体与兰尼定受体（Ryanodinereceptor）结合，抑制其活性，减少钙库动员。在MH诱因条件下，对正常人多聚体的减少不足以产生疾病表型，而Casq1发生变异时，Casq1的减少凸显，或兰尼定变异时，诱因的存在使Casq1的减少不足以抑制已改变的兰尼定受体，进而发生异常钙释放和心律失常。以上结果说明心脏Casq1改变与临床疾病表型高度吻合，因此，解决了MH发生的室性心律失常的病生理机制以及解救药丹曲洛林发挥治疗作用的理论基础。当然，这些研究也提出一些有趣的问题需要进一步研究和阐释，比如为什么Casq1多聚体在生理条件下难以有效完全敲除等，我们也就此类问题曾经通话讨论过，认为这可能与研究所用的心脏特异性Cre小鼠本身特性等相关因素有关。
此外，我们在这二种基因鼠中还发现其他心脏的表型，即在不需要诱导因素存在的基础情况下表现出明显的心脏病理性改变，这些表型的发生也与Casq1多聚体的多少有关。这是我们以后进一步重点研究的内容。
俞晓峰博士：缝隙连接蛋白Cx43磷酸化修饰有利于心脏发挥其正常功能，而相应的去磷酸化修饰则可引起心肌细胞死亡与心律失常等破坏反应，在已报道的Cx43基因约10个去磷酸化位点中，罗老师为什么会选择pSA位点进行深入研究？
罗大力教授：缝隙连接蛋白Cx43构成的缝隙通道是心肌非常重要的细胞间通讯工具，在多种心脏疾病中，Cx43发生重构，进而参与心肌细胞电紊乱致心律失常和心肌病理性损伤。生理情况下，Cx43磷酸化是极为重要的调节Cx43通道功能，以及心肌细胞稳态翻译后修饰形式。在心肌缺血，肥大，心衰和电异常患者和模型动物心脏中发现Cx43去磷酸化与心肌病理改变密切相关，但具体直接介导心肌损伤的下调磷酸化位点不清。十几年前偶然间发现一个药物可以引起心肌细胞电活动不一致，并进一步发现该药物可使Cx43丝氨酸位点磷酸化下调，进一步在药物作用的心肌细胞培养48小时后竟然导致部分死亡。由此推断Cx43-S位点磷酸化是心肌细胞电和生存稳态的关键调节靶点。
俞晓峰博士：缝隙连接蛋白Cx43基因全身敲除会导致胚胎发育障碍，敲除纯合小鼠出生后很快死亡。我们应用ES打靶技术构建的Cx43点突变（SA）小鼠，也难以获得纯合点突变小鼠，且杂合SA突变小鼠，也有约30%小鼠出生后20天内死亡，而其他杂合突变小鼠都会自发出现不同程度的心律失常等表型，这是非常有意思发现，罗老师对于这种基因突变位点相同，且表现不同程度的表型改变现象，应该如何解释或可能性推测吗？
罗大力教授：心脏中缝隙连接蛋白Cx43具有重要的多重功能，它主要功能是介导细胞间通讯，但大量的研究发现它在细胞稳态，线粒体功能和组织发生及发育中等具有极其重要的调节作用。心肌缺血性损伤、心衰时心功下降和结构的改变以及心律失常等都与Cx43的功能及其结构改变密切相关。Cx43-S单一磷酸位点突变为丙氨酸，即不能被磷酸化，呈现出无纯合子代，杂合子代有典型的心肌细胞凋亡和动物死亡，以及生存下来的动物带有持续一生的心律失常。迄今对十几种Cx43磷酸化位点的研究报道还未见发生如此重要的功能作用，说明这个位点对于Cx43蛋白功能的维系极其重要，是关键分子。我们进一步的研究发现，那些发生心肌细胞凋亡的杂合动物S磷酸化水平是最低的（下降50%），心律失常最重的，几乎也是%发生死亡的动物。而存活下来的动物磷酸化下降约30%左右，只表现出心肌的缝隙通道传导障碍和各种心律失常，包括室性心律失常。因此，这个位点的磷酸化水平改变呈现层级递阶的表型，当然其背后的信号传导机制是不同的。这些都充分体现了Cx43在心肌电和生存稳态的调节作用，而S位点极可能是发挥其调节作用的关键靶点，或关键靶点之一。
俞晓峰博士：通过手术操作，在动物体内建立缺血再灌注动物疾病模型，已成为心脏损伤相关研究的传统常用方法，而如何将获得的动物实验结果与临床相关患者实际情况联系起来，也将显得很有意义，比如临床上心律失常或心肌梗塞患者人群中，是否也存在Cx43基因pSA位点突变及其相关性如何？
罗大力教授：这是一个非常好的问题。既然Cx43-S位点极可能是发挥Cx43调节作用的关键靶点，或关键靶点之一，也参与了动物的缺血再灌注损伤和心律失常的发生。那么，在人类疾病中是否有它改变的踪迹呢？这是我们下一步重点要研究的内容。目前在收集病人的心脏样本，但寻找相对正常的对照病人的样本非常难，如果能够找到愿意合作的单位和研究人员就更好。
俞晓峰博士：由于Casq1基因缺失或Cx43基因S位点的去磷酸化修饰，都会不同程度影响到心脏正常功能作用，未来是否有可能应用基因编辑方法，比如替代相关野生基因或修正突变基因等基因疗法，达到缓解或治疗心脏相关疾病的作用？
罗大力教授：这又是一个非常好的转化问题。我们的研究发现Cx43-S位点磷酸化状态在细胞稳态维系中极其重要，这里不仅仅是其磷酸化下调与该调节作用有关，如果超过正常2倍的磷酸化上调也是极其危险信号，会出现另一种形式的细胞凋亡和电紊乱。因此，在未来可能的治疗策略中我们考虑应以化药为首选，这主要是化药的剂量可控及作用时间短。目前我们也在这方面做尝试。
专家简介
罗大力，首都医科大学药理学系教授，博士生导师
哈尔滨医科大学药理学硕士和生理学博士毕业，北京大学心血管研究所病理生理学博士后。曾在日本新泻大学和美国国立卫生研究院学习和合作研究。研究方向是心血管药理学：主要从事心脏和血管相关疾病的病生理学，和药物作用及其作用机制研究，尤其是心衰，心律失常和心肌梗死发生和发展的重要信号转导机制，以探寻新的药物靶点并进行潜在新药研发。主持国家自然科学基金项目8项和省部级各类项目9项。获省部级科学技术奖7项。在国内外杂志发表80余篇学术论文，SCI收录第一和责任作者60余篇。
俞晓峰，赛业生物中国区副总裁兼首席科学家
*事医学科学院博士，国际知名模式动物和细胞生物学专家，耶鲁大学医学院和纽约大学医学院研究员，美国基因打靶公司（iTL）和应用干细胞公司（ASC）资深科学家。在基因修饰模式动物领域有超过20多年研发与管理等方面的丰富经验，在干细胞相关领域及哺乳动物细胞系基因改造研究也取得了巨大成就，其研究成果多次发表在NatImmunol、HumMolGenet、MolCellBiol等高水平杂志上。
相关文献
1.Functionalcalsequestrin-1isexpressedintheheartanditsdeficiencyiscausallyrelatedtomalignanthyperthermia-likearrhythmia.Circulation,
2.Connexin43dephosphorylationatserineisassociatedwithconnexin43-mediatedcardiomyocyteapoptosis.CellDeathDifferentiation,
3.Connexin43dephosphorylationcontributestoarrhythmiasandcardiomyocyteapoptosisinischemia/reperfusionhearts.CellDeathDifferentiation,
